Study on the Novel Synthesis of P-32 Labeled Agents for Tracing Metabolism

대사 추적용 P-32 표지시약의 화학적 합성에 관한 연구

결과 및 고찰

짝지움 시약의 합성

Scheme 1과 같이 2 단계 과정으로 짝지움 시약(3)을 합성하였다. 화합물 (2)의 합성은 0, 질소 조건에서 실험을 하였다. 반응 진행시 Cl−과 피리딘이 반응한 피리딘염(현탁 침전물)이 생성된다. 이 피리딘염을 분리하지 않고 재결정 할 경우 용매와 생성물사이의 계면활성작용으로 화합물 (2)을 얻지 못하였다. 합성된 화합물 (2)는 연한노란색의 분말형태이며 메탄올에 약간 용해되고 HMPA와 DMSO에 쉽게 용해되었다. 화합물 (3)은 Tsujiaki Hata의 연구19를 참고하였으며 10 당량에 해당하는 페닐다이설파이드(phenyldisulfide)를 이용한 결과 화합물 (3)의 수율이 10% 미만으로 불순물도 많았다. 피리딘과 아세토나이트릴(acetonitrile) 혼합용매 조건하에 2.5 당량의 페닐다이설파이드로 화합물 (3)을 합성하였으며 TLC 결과 정량적 반응진행을 확인하였다. 사용 용매의 양을 최소 조건으로 하여 페닐다이설파이드를 첨가하였으며, 반응물(화합물 (2))이 용매에 완전히 용해되는 것을 확인하고 트리부틸포스핀(tributylphosphine)을 첨가하여야 60% 이상의 높은 수율의 화합물 (3)을 얻을 수 있었다.

Scheme 1.Reaction step in the preparation of O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate.

비교물질 ATP의 합성

[32P] γ-ATP(5)의 합성은 Scheme 2와 같으며 P-32 표지화합물의 합성조건을 알아보기 위해 안정한 원소(31P)로 ATP를 합성하였다. ATP의 합성은 2단계 반응을 한 용기반응(One-spot Reaction)으로 진행하였다. 화합물 (4)의 확인은 Ag+이 페닐설파이드기와 반응하여 생성되는 AgSPh의 침전물로 간접 확인이 가능하며 TLC로 반응을 확인하였다. 침전물은 카트리지 필터(Nylon, pore size 0.45 μl)를 이용해서 제거하였다. 화합물 (4)의 퀴놀릴기를 제거하기 위해 Cu2+를 사용했으며 크기가 비슷한 Zn2+을 사용하여도 같은 결과를 얻었다. 합성한 ATP는 시판하는 ATP와 TLC 비교를 하여 확인하였다. 최적 분리 확인 조건은 n-buOH : EtOH : H2O :NH3(1 : 1 : 1 : 1)의 전개 용매를 사용 했을 경우이며, ATP는 0.53, AMP는 0.70, 화합물 (3)은 0.85의 전개율을 나타내었다. Scheme 2와 같은 방법의 합성을 통해 P-32 표지화합물을 합성할 수 있음을 확인하였다.

Scheme 2.Reaction step in the preparation of [32P] γ-ATP using chemical processing.

비교물질 dCTP 합성

[32P] α-dCTP (8)의 합성은 Scheme 3과 같으며 표지 화합물을 합성하기 전에 안정한 원소를 이용하여 dCTP의 합성여부를 확인하였다. dCMP (6)의 합성에 있어서 H3PO4는 세위치의 작용기가 있어 CCl3CN과 반응시 여러 부반응11이 일어날 수 있다. 이와 같은 부반응으로 수득율 저하가 일어나므로 부분적 보호기 도입 과정이 필요하였다. 이를 해결하기위해 트리에틸아민(triethylamine)을 이용한 부분적 보호기를 도입하였다. H3PO4의 pKa1, pKa2, pKa3는 각각 2.12, 7.21, 12.67로서 트리에틸아민(pKa = 11.1)을 첨가하면 H3PO4의 두 작용기를 염 상태로 보호를 할 수 있다. 보호된 H3PO4는 Fig. 2의 상태이며, 무수 반응조건에서 선택적 인산화 반응이 가능하였다. 한편, 피리딘의 pKa는 5.25로서 H3PO4의 pKa1과 pKa2의 중간값을 가지며, 선택적으로 한 작용기를 보호 할 수 있었다. 합성된 dCMP는 여러 용매조건에서 확인하였으며 최적 분리 확인 조건은 C3H7OH : H2O : NH4OH(11 : 4 : 5)를 사용할 경우이며 dCMP는 0.55의 전개율을 나타내었다.

Scheme 3.Reaction step in the preparation of [32P] α-dCTP using chemical processing.

Fig. 2.Partially protected phosphoric acid with Triethylamine.

dCTP의 합성은 ATP의 합성과정과 유사한 방법으로 짝지움 시약을 이용하였다. TLC를 확인한 결과 C3H7OH : H2O : NH4OH(55 : 20 : 25) 용매 조건에서 전개율은 0.35이었으며, n-buOH : H2O : MeOH : NH4OH(1 : 1 : 1 : 1)의 용매 조건에서 전개율은 0.50이었다. 이 두 전개 용매 조건에서 dCMP와 dCTP의 합성여부를 명확히 알 수 있었다.

[32P] H3PO4 용액 분석

원자력 연구소에서 생산된 [32P] H3PO4의 생산과정에서 존재할 수 있는 다른 이온들은 주로 생산에 이용되는 표적물질, 표적 용기 및 첨가된 화학물질에 의해 나타날 수 있으며, 표지화합물을 제작하는 과정에서 방해 요인으로 작용할 수 있다. 따라서 표지화합물의 합성 시 [32P] H3PO4의 화학적 순도를 확인하였다. 완전히 감퇴된 [32P] H3PO4를 사용했으며 습식분석에 의한 음이온 분석과 ICP-AES를 이용한 양이온 분석하였다. 음이온 분석결과 Cl−, CN−, ClO42−가 존재하였으며 가장 많이 포함하는 이온은 Cl−이온임이 확인되었다. 양이온의 확인은 방사성 붕괴가 검출되지 않은 [32P] H3PO4 용액 1 ml을 20 배로 묽혀서 분석을 하였다. 그 결과 Na이 약 10 ppm, Ca이 4 ppm, Al이 4 ppm 그리고 Si 4 ppm으로 나타났다. 분석 결과 나타난 용액 속에 주로 존재하는 이온은 Cl− 이온 및 Na+ 이온이며 Cl− 이온은 친핵치환 반응을 방해하지 않는 이탈기로 작용하므로 표지화합물 합성시 문제가 되지 않는다. 원자력연구소에서 생산되는 [32P] H3PO4는 정제 없이 사용이 가능하다는 것이 확인되었다.

Table 1.Analytical data of 10-fold diluted [32P] γ-ATP solution. Element-analysis is carried out with ICP-AES and anions are analyzed with spot test

표지화합물 [32P] γ-ATP(5)의 합성

사용한 [32P] H3PO4는 2 mCi/1 ml로 HCl 수용액 상태였으며, Scheme 2와 같은 과정으로 실험 조건에 따르는 합성수율의 변화는 다음 Table 2에 나타내었다. 3 차 증류수를 이용하여 5 배로 묽힌 후 실험을 한 결과로 수득율이 약 40%이었으며 [32P] H3PO4을 묽히지 않고 반응 진행시 약 [32P] γ-ATP의 수율은 60%이었다. 감압 증류하여 수분과 HCl을 제거하여 합성한 결과 수득율은 95% 이상이었다. 위 결과를 종합하면 [32P] H3PO4 순도 및 시약의 사용량에 따라 합성 수율의 변화가 나타났으며 수분의 함유량에 따른 수율의 변화는 가장 중요한 요소라고 할 수 있다. 최적조건의 합성방법은 건조시킨 [32P] H3PO4를 이용하고 같은 당량의 전구체와 ATP, 2 당량의 질산은, 5 당량의 이염화구리를 사용한 실험 4 조건이었다. 합성된 [32P] γ-ATP의 라디오 크로마토그램은 Fig. 3와 같으며 표지수율은 97%로 재연성이 있는 결과를 얻었다.

Table 2.Preparative conditions of [32P] γ-ATP and its yield. [32P] γ-ATP is identified by Radio TLC scanning

Fig. 3.Radio TLC Scanning chromatogram of [32P] γ-ATP with n-buOH : EtOH : H2O : NH3 (1:1:1:1) as eluents Free Phosphoric acid([32P] H3PO4) and [32P] γ-ATP are identified in Rf = 0.1 and 0.54.

표지화합물 [32P] α-dCTP(8)의 합성

Scheme 3과 같은 과정의 [32P] α-dCTP의 합성은 [32P] dCMP의 합성과 짝지움 시약을 이용한 인산화로 진행된다. 사용한 [32P] H3PO4는 3 mCi/1 ml의 HCl 수용액 상태였으며 합성에 필요한 반응용기는 14/20 joint가 붙은 시험관을 제작하여 사용하였다. [32P] dCMP의 합성은 수분에 큰 영향을 받는다. [32P] H3PO4의 수용액의 수분을 1회 제거 시 10~30%, 3회 제거 시 40~55%의 [32P] dCMP의 수득율이 나타났다(Table 3. Fig. 4). 특히, 과량의 트리에틸아민을 사용할 경우 수득율이 낮은 것을 확인하였다. 최적 합성조건은 3회 건조시킨 [32P] H3PO4를 사용하고 반응에 참여 하지 않은 트리에틸아민을 제거할 경우이다. 합성한 [32P] dCMP는 sep-pak 카트리지를 이용하여 분리하였으며 짝지움 시약을 이용한 [32P] α-dCTP의 합성은 ATP 합성조건과 동일하게 진행하였다. 라디오 크로마토그램으로 확인한 결과 [32P] α-dCTP(8)의 표지 수율이 65%이었으며(Fig. 5), 전 합성과정에 따르는 표지 수율은 약 40% 이었다. [32P] α-dCTP(8)의 합성은 [32P] dCMP 합성과정이 가장 큰 영향을 주고 있음을 확인하였다.

Table 3.Preparative conditions of [32P] α-dCMP and its yield. [32P] α-dCMP is identified by Radio TLC scanning

Fig. 4.TLC Scanning chromatogram of prepared [32P] dCMP. (Distance from solvent front : 80 mm, Eluents; C3H7OH : H2O : NH4OH=55 : 20 : 25, Radio chemical yield: 55%) : Free Phosphoric acid([32P] H3PO4) and [32P] dCMP are identified in Rf = 0.1 and 0.55.

Fig. 5.TLC Scanning chromatogram of prepared [32P] α-dCTP. (Distance from solvent front : 90 mm, Eluents; n-buOH : H2O : MeOH : NH4OH=1:1:1:1, Radio chemical yield: 65%) : [32P] α-dCTP was prepared using sep-pak filtered [32P] dCMP. Free Phosphoric acid([32P] H3PO4) and [32P] α-dCTP are identified in Rf = 0.1 and 0.50.

 

실 험

시약 및 기기

방사성 동위원소 P-32는 한국원자력 연구소에서 생산된 [32P] H3PO4를 이용하였으며, 1-chloro-8-hydroxyquinoline, phenyl disulfide와 adenosine 5'-monophosphate은 Acrose사의 제품을, 질산은, 이염화구리(CuCl2), H3PO4는 Aldrich사의 제품을, 그 밖의 반응 용매들은 Aldrich 및 Merck사의 특급시약을 이용하였다. 방사성 동위원소를 이용한 실험을 위해 반응 초자 기구는 Aldrich사의 KONTES MICROSCALE GLASSWARE KIT를 이용하여 간이 반자동합성장치를 제작하여 사용하였다. 합성 확인에 사용한 TLC는 Merck사의 Silica gel 60 F254를 이용하였으며 발색 기구 및 시약으로는 UV-램프 및 I2를 이용하였다. IR은 Bomen 100 FT-IR Spectrophotometer를, NMR은 Varian사의 Gemini 200을 이용하였으며 질량분석은 고려대학교 기초과학지원센타의 고성능액체 크로마토그래피/질량분석기(FAB)를 이용하였다. 라디오크로마토그램은 Bioscan사의 System 200 imaging scanner와 AC-3000을 이용하였다. 양이온 분석을 위해 GBC Scientific Equipment Pty Ltd사(GBC Integra XMZ-Australia)의 ICP-AES를 사용했다.

5-Chloro-8-quinolyl phosphate (2)의 합성

질소 조건에서 피리딘과 1,4-다이옥산 동량의 혼합 용매(30 ml)에 POCl3 3.11 ml를 녹인 후 1,4-다이옥산 10 ml에 용해시킨 5-chloro-8-hydroxy quinoline을 0 ℃에서 소량씩 첨가한다. 5시간 동안 교반시킨 후 필터한 후 용액을 감압 증류하고 피리딘과 물(1 : 1) 혼합용액 10 ml를 0 ℃에서 천천히 첨가한다. 용매를 감압 증류한 후 아세토나이트릴과 물(1 : 1) 혼합용액을 이용하여 1차 침전물을 얻었으며 아세토나이트릴을 이용하여 2차 재결정하여 수득율이 63%(1.8 g)인 화합물 (2)(5-chloro-8-quinolyl phosphate)를 얻었다.

TLC (n-buOH : MeOH : H2O : NH4OH=1 : 1 : 1 : 0.5): Rf= 0.25. mp=127. 1H NMR (DMSO): δ=9.02(dd; 1 H, Ar-H), 8.55(dd; 1 H, Ar-H), 7.73(m; 3 H, 3Ar-H), 5.32 (broad; 2 H, 2 P-OH) MS(FAB, M++1): C9H7ClNO4P cald. for 259.98 found 260.07.

O-8-(5-chloroquinolyl) S-phenyl phosphorothiate (3)의 합성

질소 분위기에서 1 g(3.86 mmol)의 화합물 (2)를 3 ml의 피리딘과 15 ml의 아세토나이트릴 용매에 첨가한다. 실온에서 2.1 g(9.65 mmol)의 페닐다이설파이드(phenyldisulfide)를 넣고 4.8 ml(19.30 mmol)의 삼부틸포스핀(tributylphosphine)을 천천히 가한다. 1시간 반응 뒤 용매를 제거한 후 클로로포름용액을 이용하여 유기물을 추출한다. 생성 혼합물을 다이클로로메탄에 녹인 후 아세토나이트릴과 0.88 ml (7.72 mmol)의 사이클로헥실아민을 첨가하여 -20 ℃에서 재결정시켜 연한 노란빛을 띠는 백색결정의 생성물을 합성하였으며, 수득율은 68%(1.18 g)이었다.

TLC(MC :MeOH, 7 : 3): Rf=0.65. 1H NMR(CD3OD): δ=8.86(dd; 1 H, quinoline-H), 8.67(dd; 1 H, quinoline-H), 7.89(dd; 1 H, quinoline-H), 7.69(q; 1 H, quinoline-H), 7.65(d; 1 H, quinoline-H), 7.40(m; 2 H, 2Ar-H), 7.20(m; 1 H, Ar-H), 7.13(m; 1 2H, 2Ar-H), 5.32(broad; 2 H, 2 P-OH). MS(FAB, M++1): C21H24ClN2O3PS cald. for 451.09 found 451.20.

비교물질 ATP(5)의 합성

동량의 1-메틸피롤리돈(MPD)과 헥사메틸포스포아마이드(HMPA) 혼합 용매 6 ml에 100 mg(0.22 mmol)의 화합물 (3)과 77 mg(0.22 mmol)의 AMP(Adenosine monophosphate)를 첨가하여 10분 간 교반한 후 45 mg(0.26 mmol)의 질산은을 넣어 30분 간 반응을 진행한다. 합성된 화합물(4)는 분리하지 않고 연속하여 38 μl(0.66 mmol)의 인산과 150 mg(1.1 mmol)의 이염화구리(CuCl2)를 첨가 후 12시간 동안 반응을 진행시켰다. 합성된 ATP는 TLC를 이용하여 확인하였다.

TLC (n-buOH : MeOH : H2O : NH4OH= 1 : 1 : 1 : 1): Rf =0.54.

비교물질 dCMP 및 dCTP의 합성

질소 분위기하에서 30(0.5 mmol)의 인산에 아세토나이트릴을 첨가하고 감압 증류를 2회 진행한다. 1 ml (7 mmol)의 트리에틸아민을 첨가하여 감압 증류한 뒤 200 μl의 아세토나이트릴을 첨가한다. 다른 반응용기에 20 mg(0.08 mmol)의 데옥시시티딘(deoxycytidine monohydrate)을 넣은 후 아세토나이트릴을 이용하여 수분을 제거한다. 200 μl의 DMSO와 100 μl(1 mmol)의 삼염화아세토나이트릴(CCl3CN)를 첨가하고 교반 후 인산이 들어있는 반응용기에 옮겨 40 ℃에서 30분 간 방치한다. 합성된 화합물 (6)은 시판하는 dCMP와 TLC로 비교하였다. 생성 혼합물 (6)을 감압 증류하여 한 뒤 1-메틸피롤리돈과 헥사메틸포스포아마이드의 1 : 1 혼합 용매 4 ml 를 첨가한 후 45 mg(0.26 mmol)의 질산은과 100 mg(0.22 mmol)의 화합물 (3)을 첨가하고 30분간 교반시킨다. 계속하여 30 μl(0.5 mmol)의 인산과 100 mg(0.73 mmol)의 이염화구리를 첨가한 후 상온에서 12시간 반응을 진행한다. 합성된 dCTP는 시제품과 TLC비교를 하여 확인하였다.

TLC (C3H7OH:H2O:NH4OH=11:4:5): dCMP (Rf=0.55), dCTP (Rf =0.35)

TLC (n-buOH : MeOH : H2O : NH4OH=1 : 1 : 1 :1): dCTP (Rf =0.50)

표지화합물 [32P] γ-ATP(5)의 합성

β선 차폐제로서 10 mm 아크릴 판을 이용하였으며 제작된 Microscale vial를 이용하여 합성을 진행하였다. 0.9 ml의 1-MPD와 0.3 ml의 HMPA 의 용매에 13 mg(0.029 mmol)의 화합물 (3)과 10 mg(0.029 mmol)의 AMP 을 첨가하고 10분 간 교반시킨 후 10 mg(0.058 mmol)의 질산은을 첨가하여 30분간 교반시킨다. 아세토나이트릴을 이용한 불변혼합 증류를 통해 2회 건조시킨 0.2 mCi의 [32P] H3PO4에 위 혼합용액을 섞은 후 19 mg(0.14 mmol)의 이염화구리를 첨가하고 3 시간 교반하여 [32P] γ-ATP(5)를 합성하였다. 합성확인 및 표지 수율은 라디오크로마토그램을 이용하였다.

TLC (n-buOH : MeOH : H2O :NH4OH=1 : 1 : 1 : 1): Rf =0.54. Radiochemical yield: 95%.

표지화합물 [32P] dCMP(6)의 합성

10 mm 아크릴 판으로 β선 차폐한 조건에서 14/20 연결고리가 달린 시험관에 0.3 mCi (100 μl) [32P] H3PO4를 취한다. 100 μl의 트리에틸아민을 첨가 하고 1 ml 의 아세토나이트릴을 이용하여 30 ℃ 조건에서 3회 감압 증류하고 고무마개로 밀봉시킨다. 다른 반응용기에 20 mg(0.08 mmol)의 데옥시시티딘(deoxycytidine monohydrate)을 넣은 후 100 μl의 DMSO와 3 μl의 삼염화아세토나이트릴(CCl3CN)를 첨가하고 교반 후 밀봉된 인산용기에 옮겨 40 μl 조건에 30분간 방치한다. 합성확인 및 표지 수율은 라디오크로마토그램을 이용하였다.

TLC (C3H7OH : H2O : NH4OH=11 : 4 : 5): Rf = 0.55. Radiochemical yield: 55%.

표지화합물 [32P] α-dCTP(8)의 합성

화합물 (6)를 sep-pak 분리 후 동량의 1-메틸피롤리돈과 헥사메틸포스포아마이드 4 ml를 첨가한다. 13 mg의 화합물 (3)을 첨가한 후 10 mg의 질산은을 첨가 후 30분간 교반시킨다. 계속하여 30 μl(0.5 mmol)의 인산과 100 mg(0.73 mmol)의 이염화구리를 첨가한 후 3시간 동안 반응하여 [32P] α-dCTP를 합성하였다.

TLC (n-buOH : MeOH : H2O :NH4OH=1 : 1 : 1 : 1): dCTP (Rf= 0.50). Radiochemical yield: 65%.

 

결 론

O-8-(5-chloroquinolyl) S-phenyl phosphorothiate의 총 합성수율은 42%이었으며 합성 확인은 NMR, IR, TLC를 이용하였다. 화합물 (3)을 이용한 [32P] γ-ATP의 합성은 최적 조건하에서 95% 이상의 높은 표지 수율을 얻었으며 총 합성 시간은 4시간이 소요되었다. [32P] α-dCTP의 합성은 총 합성 수율은 약 35-40% 정도였다. 합성 시간은 총 6시간이 소요되었다. 화학적 합성을 통한 P-32 표지화합물의 제작은 [32P] γ-ATP(위치 표지)의 경우 높은 수득율을 얻었으며, [32P] α-dCTP (α위치 표지)의 합성은 [32P] dCMP 합성에 크게 의존하며 Sep-pak 분리 시 손실이 있었다. 이와 같은 합성법은 기존 효소반응과 비교하여 반응시간이 짧게 소요된다. 특히, [32P] γ-ATP의 경우 경제성과 효율성이 좋다고 판단되며 대량생산체계가 가능하다고 사료된다.

본 연구는 원자력연구개발과제 중 하나로 이용 연구지원사업의 지원에 의해 수행되었으며, 연구 수행에 도움을 준 원자력의학원 싸이크로트론응용연구실에 감사의 글을 드립니다.