Microsomal Proton Transport Activity Measured by Quinacrine Fluorescence from Tomato Roots

Quinacrine 형광을 이용한 토마토 뿌리조직 마이크로솜의 수소이온이동 활성측정

Quinacrine, a pH-sensitive fluorescence probe, which exists either as an unprotonated fluorescence form or a protonated noufluorescence form, can be used to measure the proton transport activity of $H^+-ATPase$. Quinacrine was used to determine the optimal conditions for measuring the activity of microsomal $H^+-ATPase$ prepared from the roots of tomato plants. The amount of quinacrine fluorescence quenching obtained at $0.43{\mu}g/{\mu}l$ of microsomal protein concentration was 25-26%, which shows that the enzyme activity of 100 nmol/min decreases 10% of quinacrine fluorescence. Maximal fluorescence quenching was obtained at pH 7.0-7.2 and 2 mM $Mg^{2+}$ Because the activity of microsomal $H^+-ATPase$ is also maximal at these conditions, the quinacrine fluorescence well represents the activity of $H^+-ATPase$. Vanadate and $NO_3-$, specific inhibitors of plasma and vacuolar $H^+-ATPases$, respectively, were successfully applied to inhibit the quinacrine fluorescence quenching mediated by the corresponding $H^+-ATPases$. These results imply that quinacrine is a useful tool for measuring the proton transport activities of microsomes obtained from the root tissue of tomato plants.

Quinacrine은 수소이온 농도변화에 민감한 형광 probe로서 양성자와 결합하지 않은 형광형이나, 양성자와 결합한 비형광형으로 존재한다. 따라서, quinacrine은 $H^+-ATPase$에 의한 수소이온이동 활성 측정에 이용된다. 본 연구에서는 토마조 뿌리조직에서 분리한 마이크로솜에서 quinacrine의 형광성을 이용한 $H^+-ATPase$ 활성측정의 최적 조건을 조사하였다. Quinacrine의 형광변화는 반응용액 중의 단백질 함량이 $0.43{\mu}g/{\mu}l$에서25-26% 감소하여 10%의 quinacrine 형광을 감소시키는 데 약 100nmo1/min의 $H^+-ATPase$ 활성이 필요함을 알 수 있었다. Quinacrine의 최대 형광변화는 pH 7.0-7.2 범위와 $2mM\;Mg^{2+}$ 조건에서 일어났다. 이것은 기존에 보고한 $H^+-ATPase$의 특성과 일치하여, quinacrine의 형광변화가 $H^+-ATPase$의 활성을 잘 반영하고 있음을 보인다. 원형질막 및 액포막 $H^+-ATPase$들의 선택적 저해제인 vanadate와 $NO_3-$는 각각의 효소에 의한 수소이온이동 활성을 저해하는데 성공적임을 확인하였다. 이상의 결과로 quinacrine이 토마토 뿌리조직에서 분리한 마이크로솜의 수소이온이동 활성측정에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.