Detection of Mycobacterium Tuberculosis by In Situ Hybridization

조직내교잡법을 이용한 결핵균의 검출

Background : A presumptive histopathologic diagnosis of tuberculosis is commonly based on the finding of acid-fast bacilli upon microscopic examination of a diagnostic specimens. Although this traditional histochemical staining method is satisfactory, it is time-consuming and not species-specific. For more specific assessment, in situ hybridization assay with oligonucleotide probes is introduced. Methods : The human surgical specimens were obtained from tuberculosis patients, and experimental specimens were made by injecting cultured M. tuberculosis organisms into fresh rat liver. Oligonucleotide probes complementary to ribosomal RNA portion were synthesized and labeled with multiple biotin molecules. For a rapid detection, all procedures were carried out using manual capillary action technology on the Microprobe staining system. Results : The in situ hybridization assay produced a positive reaction in experimental specimens (80-90% sensitivity) after pepsin-HCl pre-treatment for a good permeabilization of probes, but reliable result was not obtained from human surgical specimens. Conclusion : It is, therefore, suggested that biotin-labeled oligonucleotide probes have considerable potential for identification and in situ detection of M. tuberculosis but, there are some barriers to overcome for the diagnostic use of this method.

배경 : 올리고누클레오티드 탐식자를 이용한 조직내교잡법은 감염성 질환의 진단에 이용되고 있는 분자병리학적 검사방법이다. 그러나 결핵균의 세포벽에는 다량의 지방 성분이 포함되어 있어 탐식자의 침투에 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 탐식자의 침투력을 높일 수 있는 조건을 알아보고, 결핵의 조직학적 진단법으로써 조직내교잡법의 이용 가능성을 확인해 보고자 한다. 방법 : 결핵으로 진단된 환자의 인체조직 절편과 배양된 결핵균을 흰쥐의 간 조직 내에 인위적으로 주입하여 제작한 실험조직 절편을 실험대상으로 하고, 바이오틴을 부착시킨 올리고누클레오티드 탐식자를 이용하여 조직내교잡법을 시행하였으며, 탐식자의 효과적인 침투를 위해 전처리를 시도하였다. 결과 : 펩신-염산 (2 mg/ml, 0.1M) 혼합액을 이용한 전처리 과정 (5-6분) 후 조직내교잡법을 수행한 결과 배양된 결핵균을 주입한 실험조직에서 결핵균의 검출에 성공할 수 있었다. 간 조직이 주사바늘에 의해 기계적으로 손상된 자리를 따라 군데군데 위치하고 있는 배양액 내에서 불규칙하게 모여있는 점상 혹은 간상의 양성반응을 관찰할 수 있었으며, 민감도는 80-90% 수준이었다. 그러나 결핵환자의 조직절편에서는 조직내교잡법을 이용하여 결핵균을 검출할 수 없었다. 결론 : 이는 배양액 내에서 빠르게 증식하는 결핵균과는 달리 인체에 감염된 결핵균에서는 rRNA의 양이 적어, 바이오틴이 부착된 탐식자를 이용한 조직내교잡법의 민감도를 벗어났을 것으로 추정된다. 따라서 향후 조직내교잡법으로 인체조직 내의 결핵균을 진단하기 위해서는 제자리 중합효소연쇄반응 (in situ PCR) 법의도입이나, 보다 높은 민감도를 갖는 동위원소를 부착 시킨 탐식자의 사용이 필요하다고 생각된다.