해산 녹조류 참홑파래, Monostroma nitidum의 원형질체 분리와 분화

Protoplast Isolation and Differentiation of Marine Green Alga Monostroma nitidum

해산 녹조류 참흩파래, Monostroma nitidum의 엽체를 효소처리하여 다량의 원형질체를 분리하였다. 최적 효소액의 조합은 $4\%$ R-10+$3\%$ Macerozyme R-10+$3\%$ Abalone acetone power로서 생체조직 300mg 당 $4.41\times10^6$개의 원형질체가 분리되었다. 원형질체의 수율은 효소처리 270분에 최대였다. 분리 직후의 원형질체는 구형으로 직경 $13\~33\mu$m의 크기였다. 분리된 원형질체는 0.4M mannitol을 함유한 f/2배지에서 배양한 후 매주 mannitol이 함유되지 않은 f/2 배지로 절반씩 교환함으로서 분화율을 높일 수 있었다. f/2배지를 사용한 적정 배양조건에서 원형질체는 배양 3일 후 새로운 세포벽을 형성하였으며 10일 후 발아하기 시작하여 엽체로 발달하였다. 항생물질의 배지내 첨가는 배양체의 분화를 저해하였다.

High yields of protoplasts were obtained following enzymatic digestion of the vagetative thalli of marine green alga Monostroma nitidum. The enzyme mixtures containing $4\%$ Cellulase R-10+$3\%$ Macerozyme R-10+$3\%$ Abalone acetone power produced $4.41\times10^6$ protoplasts per 300 mg of fresh tissue. The highest yield of protoplasts was obtained by 270 minutes treatment of the thalli in enzyme solution. Freshly isolated protoplasts were spherical in shape and ranged between $13\~33\mu$m in diameter. The high efficiency of differentiation were obtained by incubating freshly isolated protoplasts in 0.4 M mannitol f/2 medium for 7 days and then transferring to 0.2 M mannitol f/2 medium. Protoplasts began to form new cell walls three days after initial culture and began to germinate after 10 days, and then form a leafy thallus after further culture in f/2 medium. The addition of antibiotics in media inhibited the differentiation of protoplasts in culture.