Expression, Purification and Characterization of Yeast Thioredoxin System.

Yeast Thioredoxin System의 발현, 정제 및 특성조사

We carried out the expression and characterization of yeast thioredoxin system including thioredexin 1 (Trx1), Trx2, thioredoxin reductase (TR), and a novel thioredoxin (Trx3), which was reported in the data base of Saccharomyces genome. The Trx1, 2 and TR were expressed as soluble proteins in E. coli and the sizes of purified proteins were equal to the reported their molecular weights. The expressed Trx3 was found in both soluble fraction and precipitate. The size of Trx3 purified from soluble fraction of E. coli crude extracts was estimated as 14 kDa on SDS-PAGE instead of 18 kDa for Trx3 in precipitate. N-terminal amino acid sequence of the small size of purified Trx3 from soluble fraction was analyzed as FQSSYTS which is correspond to the sequence from 20 to 26 for Trx3. Trx3 together with thioredoxin reductase and NADPH was able to reduce the disulfide bridge of insulin and 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB). Trx3 stimulated the antioxidant effect of thioredoxin peroxidase 1 (TPx1) which inhibited inactivation of glutamine synthetase (GS) in dithiothreitol (DTT) containing metal catalyzed oxidation system. The stimulation effect of Trx3 was 10% of the effect of either Trx1 or Trx2. In addition, Trx3 could reduce the disulfide of TPx to thiol, so that the TPx had thioredoxin dependant peroxidase activity. In western blotting analysis, antibodies against purified Trx3 did not cross-react with crude extracts of yeast, purified Trx1, and Trx2 proteins. But, in PCR reaction using the cDNA library of yeast as a template, gene encoding of trx3 was amplified.

효모의 전체 게놈서열에서 확인된 새로운 티오레독신(Trx3)과 이미 효모에서 티오레독신으로서의 기능이 보고된 Trx1, 2 및 TR을 대장균에 발현시켜 정제후 활성을 비교, 조사하였다. Trx1, 2 및 TR은 대부분 수용성 분획에 발현되었으며, 이로부터 정제한 단백질의 분자량은 보고된 분자량과 일치하였다. Trx3는 수용성 분획과 침전 분획 모두에서 발현되었으며, 수용성 분획으로부터 정제한 Trx3의 분자량은 14 kDa이었고, 침전 분획의 Trx3는 18 kDa였다. 수용성 분획으로부터 정제한 Trx3의 아미노말단의 아미노산 서열은 FQSSYTS로 분석되었으며 이는 보고된 Trx3의 20번에서 26번의 아미노산에 해당하였다. NADPH, 티오레독신 환원효소와 함께 Trx3는 인슐린과 DTNB의 disulfide 결합을 환원시켰다. Trx3는 디티오트레이톨을 포함하는 금속촉매산화계에 의한 효소 불활성화를 억제하는 TPx1의 항산화효과를 증가시켰으며, TPx1의 항산화활성을 증가시키는 Trx3의 활성은 Trx1 또는 2의 10% 수준이었다. 또한 Trx3는 TPx1의 disulfide를 thiol로 환원시켜 TPx가 티오레독신 의존성 과산화물 분해활성을 갖도록 하였다. Western blotting실험 결과, Trx3에 대한 항체는 효모 조추출물과 정제된 Trx1 및 Trx2와는 교차반응 하지 않았다. 그러나, 효모 CDNA 유전자 은행을 template로 한 PCR 실험 에서는 Trx3를 암호화하는 유전자가 증폭되었다.