Expression and Secretion of Trichodema Endoglucanase in Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae에서 Trichoderma Endoglucanase의 발현과 분비

The endoglucanase gene, egl6, of Trichoderma sp. was connected with the yeast ADH1 promoter, and the resultant plasmid, pVT-C4, was introduced into three S. cerevisiae host strains (YNN27, 2805, and SEY2102). Among each 80 transformants, the cell growth and expression level of endoglucanase were compared in test-tube cultivation, and three respective transformants for each host cells showing the highest expression level and cell growth were selected. When three recombinant yeast cells were batchwise cultivated for 48 hr in flask, the total activities of endoglucanase expressed were about 1140 unit/l with 2805/pVT-C4, 1020 unit/l with SEY2102/pVT-C4, and 590 unit/l with YNN27/pVT-C4. Irrespective of host strain, about 80% of the expressed endoglucanase was detected in the extracellular medium. In addition, it was also found that the recombinant enzyme was secreted into the culture medium as two major forms of lightly and heavily glycosylated proteins.

Trichoderma sp. C-4 유래의 endoglucanase 유전자(egl6)를 ADH1 promoter 하류에 연결하여 구성적 발현 plasmid인 pVT-C4를 제작하였다. 이를 3종의 S. cerevisiae숙주세포(YNN27, 2805, SEY2102)에 형질전환시켜 각 숙주세포당 80개의 형질전환체를 시험배양하여, 균체증식과 endoglucanase 발현량이 뛰어난 형질전환 효모 균주를 선별하였다. 3종의 재조합 효모를 YPD 배지에서 회분 배양했을 때, YNN27 균주가 가장 낮은 균체농도(OD$_{600}$=19)를, 2805 균주가 가장 높은 균체농도(OD$_{600}$=33)를 보였으며, 총 발현된 endoglucanase 활성은 균체농도에 의존적인 양상으로 나타나 YNN27의 경우 586 unit/l, SEY2102의 경우 1023 unit/l, 2805의 경우 1142 unit/l 순서로 증가하였다 비활성(균체농도당 endoglucanase활성 )은 세 균주 모두 31~34 unit/l/OD$_{600}$ 값을 보여 단위 균체당 발현능 차이는 거의 없었다. Plasmid 안정성은 배양 72시간에서 세 균주 모두 80% 이상의 높은 값을 보였다. 발현된 endoglucanase의 분비 국재성은 세포밖 배지에 약 80%, periplasmic space 잔존 활성이 11~13%, 세포질 분획에서의 활성이 8~10% 정도로 세 균주에서 모두 비슷한 분포를 보였다. 즉, egl6의 분비신호는 S. cerevisiae에서도 매우 효율적으로 분비 기능을 발휘하였다. 재조합 endoglucanase는 nondenaturing-PAGE 상에서 전형적인 당단백질의 disperse band를 두개 보였다. 세가지 숙주세포에 따른 재조합 endoglucanase활성 band들의 이동상의 차이는 거의 나타나지 않고, 당쇄부가 양상은 야생형보다 훨씬 더 복잡하고 불균일하게 발생했음을 알 수 있었다.수 있었다.