Abstract
Background: Among the injurious agents to which the lung airspaces are constantly exposed are reactive species of oxygen. It has been widely believed that reactive oxygen species may be implicated in the etiology of lung injuries. In order to elucidated how this oxidant causes lung cell injury, we investigated the effects of exogenous $H_2O_2$ on alveolar epithelial barrier characteristics. Methods: Rat type II alveolar epithelial cells were plated onto tissue culture-treated polycarbonate membrane filters. The resulting confluent monolayers on days 3 and 4 were mounted in a modified Ussing chamber and bathed on both sides with HEPES-buffered Ringer solution. The changes in short-circuit current (Isc) and monolayer resistance (R) in response to the exogenous hydroperoxide were measured. To determine the degree of cellular catalase participation in protection against $H_2O_2$ injury to the barrier, experiments were repeated in the presence of 20 mM aminotriazole (ATAZ, an inhibitor of catalase) in the same bathing fluid as the hydroperoxide. Results: These monolayers have a high transepithelial resistance (>2000 ohm-$cm^2$) and actively transport $Na^+$ from apical fluid. $H_2O_2$(0-100 mM) was then delivered to either apical or basolateral fluid. Resulting indicated that $H_2O_2$ decreased Isc and R gradually in dose-dependent manner. The effective concentration of apical $H_2O_2$ at which Isc (or R) was decreased by 50% at one hour ($ED_{50}$) was about 4 mM. However, basolateral $H_2O_2$ exposure led to $ED_{50}$ for Isc (and R) of about 0.04 mM. Inhibition of cellular catalase yielded $ED_{50}$ for Isc (and R) of about 0.4 mM when $H_2O_2$ was given apically, while $ED_{50}$ for basolateral exposure to $H_2O_2$ did not change in the presence of ATAZ. The rate of $H_2O_2$ consumption in apical and basolateral bathing fluids was the same, while cellualr catalase activity rose gradually with time in culture. Conclusion: Our data suggest that basolateral $H_2O_2$ may affect directly membrane component (e.g., $Na^+,\;K^+$-ATPase) located on the basolateral cell surface. Apical $H_2O_2$, on the other hand, may be largely degraded by catalase as it passes through the cells before reaching these membrane components. We conclude that alveolar epithelial barrier integrity as measured by Isc and R are compromised by $H_2O_2$ being relatively sensitive to basolateral (and insensitive to apical) $H_2O_2$.
연구배경 : 정상 폐상피세포에서는 항상 생성되고 있는 활성산소(oxygen radical)에 의한 유해작용에 노출되어 있고, 이들 유해 산소들은 폐기종과 같은 폐질환의 원인 기전으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 이 방법을 이용하여 만든 폐상피세포 단일막에서 전기생리학적인 관점에서 물질의 이동지표인 short-circuit current(Isc)와 조직저항(R)에 대한 활성산소의 하나인 $H_2O_2$(hydrogen peroxide)가 어떤 영향을 미치는지를 연구함으로서 세포생리학적 기전을 구명하고자 한다. 방법 : Tissue culture-treated polycarbonant membrane filter 에서 배양시킨 쥐 제 2 형 폐상피세포 배양 단일막에서 $H_2O_2$의 능동적 이온 이동 (Isc) 과 수동적 용질이동에 대한 조직저항(R)에 미치는 효과를 관찰하였다. 배양 제 3 일과 제 4 일째 단일막을 수정된 Ussing chamber에 설치하고 막 양측에 HEPES-buffered Ringer 용액으로 incubation 하였다. 외부에서 0~100 mM 농도의 $H_2O_2$를 apical 또는 basolateral side에 작용시켜 Isc와 R의 변화를 관찰하였다. 폐상피세포 장벽이 외부의 $H_2O_2$에 대하여 방어작용을 가지는 세포내 catalase 활성도를 측정하고, catalase 억제제인 aminotriazol(ATAZ) 20 mM의 효과도 함께 관찰하였다. 결과 : 이 단일막은 형태학적으로 보아서 in vivo 에서의 포유류 제 1 형 폐상피세포 장벽의 특성을 나타내고 세포들 사이는 tight junction을 이루며(조직저항 R: 2,000 ohm-$cm^2$ 이상) sodium ion의 능동적 이동 (Isc: 5 ${\mu}A/cm^2$)을 보였다. $H_2O_2$는 dose-dependent 양식으로 Isc와 R 모두 감소시켰다. Apical side에 작용하는 $H_2O_2$에 있어서는 60분에 50% 억제하는 농도인 $ED_{50}$는 Isc와 R은 약 4mM 이었으나 basolateral side의 경우는 약 0.04mM 로서 그 작용 강도는 apical에 비하여 약 100배 정도 더 컸다. ATAZ 존재시 apical side의 $ED_{50}$는 0.4mM로 감소하였으나 basolateral side의 경우 변화가 없었다. $H_2O_2$의 제거율은 apical 또는 basolateral side 어느 쪽에 존재하든 같았으며, 세포내 catalase 활성도는세포배양기간이 길어짐에 따라 증가함을 보였다. 결론 : 이상의 실험결과는 basolateral side에 작용하는 $H_2O_2$는 세포내 막구성성분 중 basolateral 측에 존재하는 곳에(예, $Na^+,\;K^+$-APTase) 직접 장애를 미칠 것으로 생각된다. 한편 apical side에 작용하는 $H_2O_2$는 막성분에 도달하기 전에 세포내에 존재하는 catalase에 의하여 대부분 그 작용을 잃게 된다. 결론적으로 Isc와 R로 측정된 폐상피세포 장벽의 특성은 $H_2O_2$에 의하여 손상을 받고 apical side 보다는 basolateral side 측정이 더 손상을 잘 받게 된다.
(Department of Physiology, College of Medicine, Dong-A University)
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