Simultaneous Determination of Diazepam and Its Metabolites in Urine by HPLC, and Its Clinical Pharmacokinetic Application

HPLC에 의한 소변 내 Diazepam 및 그 대사물의 동시측저업과 임상약동학적 응용

Background : The kinetic and metabolic disposition of diazepam have been studied by measuring its concentration in plasma or serum. However, the informations available on the urinary excretions of diazepam and its metabolites in human are limited. Hence, to facilitate the investigation of the metabolic disposition of diazepam employing human urine samples, a simple high-performance liquid chromatographic method was developed to method diazepam and its major metabolites. N-desmethyldiazepam, temazepam and oxazepam in urine, and used this method in a preliminary study of diazepam metabolism in 6 healthy male volunteers. Methods : One milliliter of urine, acetate buffer and ${\beta}$-glucuronidase/sulfatase were incubated. After, dichlormethane was added, the sample was extracted by shaking and centrifugation. Then, re-extraction was conducted with adding of hexane, HCI and dichlormethane. The residue of the extract was dissolved in the mobile phase and then was injected into the HPLC apparatus. Results : The assasy allows simultaneous determination of all analytes in 1 mL of urine and can be used to detect 2 ng/mL with a signal-to-noise ratio of 3. Recoveries of the analytes and the internal standard (prazepam) were > 82.9%. Intra- and interassay coefficients of variation for all analytes were <4.8 and 8.7% at 10 ng/mL, and they were <2.4 and 5.5% at 100 ng/mL, respectively. Relative intra- and interassay errors ranged from -7.7 to +7.3 at 10 ng/mL. and from -1.9 to +0.6% at 100 ng/mL. The mean(${\pm}SD$) cumulative urinary excretions of diazepam, desmethylidiazepam, temazepam and oxazepam over 96 h after on oral administration of 4 mg of diazepam were $0.27{\pm}0.12,\;3.89{\pm}0.36,\;6.64{\pm}1.41\;and\;2.76{\pm}0.56%$ of the dose, respectively. Conclusion: Thus, the present method is more practical and precise to investigate the diazepam metabolism non-invasively in a large number of volunteers and patients.

연구 배경 : Benzodiaxepine계의 대표적 약물인 diazepam 은 간장에서 desmethyldiaxepam, temazepam 및 oxazepam으로 대사된다. Diazepam의 약물반응은 개체간에 차이가 많으며 이 개체간의 차를 규명하기 위해서 약동학적인 분석방법이 필요할 것이나 아직까지 소변에서 diazepam 및 그 대사산물들의 동시측정법은 확립되어 있지 않다. 본 연구에서는 사람의 소변으로 배설되는 diazepam과 대사산물을 고속액체 chromatography를 이용하여 동시측정할 수 있는 방법을 개발하고 이의 임상약동학적인 응용가능성을 검토하였다. 방법 : 각 분석물질의 측정을 위해 소변 1 mL에 acetate buffer, beta-glucuronidase/arylsulfatase를 첨가하고 incubation시킨 후, prazepam을 internal standard로 하여 dichlormethane으로 2회 및 HCI로 extraction 시킨 후 그 extract를 고속액체 chromatography에 주사하였다. 이 분석방법의 임상약리학적인 응용가능성을 검토하기 위하여 6명의 건강한 남자 자원자에게 4mg의 diazepam을 투여한 후 각 분석물질의 경시적인 소변으로의 배설양을 측정하였다. 결과: 소변 내 diazepam과 그 대사산물들의 검출한계(detection limit)는 2ng/mL이었고 각 분석물질들의 회수율은 82.9% 이상이었다. Intra-assay 및 interassay의 변동계수는 10 ng/mL인 경우에는 4.8% 및 8.7%, 100ng/mL인 경우에는 2.4% 및 5.5% 이하로 각각 나타났으며 상대오차는 각각 10ng/mL에서는 -7.7%에서 +7.3%, 100 ng/mL에서는 -1.9%에서 +0.6%의 범위에 있었다. 또한 diazepam을 경구투여한 자원자에서의 96시간 축적된 각 분석물질의 배설양은 temazepam이 $6.64{\pm}1.41%$로 가장 많았으며 diazepam은 $0.27{\pm}0.12%$로 가장 적었다. 결론: 따라서 본 연구에서 개발한 고속액체 chromatogrpahy에 의한 소변 내 diazepam 및 그 대사산물들의 동시측정법은 간편하고 실용적이며 정확하여, 많은 수의 자원자와 환자에게서 비침습적인 방법으로 diazepam의 대사 및 임상약리학적 연구에 적합하다고 사료된다.