Secretion of Bacillus subtilis Endo-1,4-$\beta$-D-Glucanase in Yeast Using Promoter and Signal Sequence of Glucoamylase Gene

Glucoamylase 유전자의 promoter 와 분비신호서열을 이용한 Bacillus subtilis Endo-1-4$\beta$-D-Glucanase 의 효모에서 분비

For the development of a glucanolytic yeast strain. the seceretion of endo-1.4-$\beta$-D-glucanase (CMCase) of Bacillus subtilis was performed in yeast using glucoamylase gene (STA1) of Saccharomyces diastaticus. A 1.7 kb-DNA fragment of STA1 gene containing authentic promoter, signal sequence, threonine serine-rich (TS) region and N-terminal region (98 amino acids) of mature glucoamylase was ligated to YEp 24. E. coli-yeast shuttle vector. And then. CMCase structural gene of B. subtilis was fused in frame with the 1.7 kb-DNA fragment of STA1 gene, resulting in recombinant plasmid pYES('24. Yeast transformant harboring pYESC24 had no CMCase activity. So. we deleted TS region and N-terminal region of mature glucoamylase existing between signal sequence and CMCase structural gene in pYESC24. consequently constructed recombinant plasmid pYESC11. The yeast transformed with the newly constructed recombinant plasmid pYESC11 efficiently secreted CMCase to extracellular medium. After 4 days culture. total CMCase activity of this transformant was 44.7 units/ml and over 93% of total CMCase activity was detected in culture supernatant.

STA1 유전자의 promoter 와 분비신호서열을 이용하여 B. subtilis 의 CMSase 를 분비하는 재조합 효모균주를 육성하였다. STA1A 유전자의 promoter, 분비신호서열, TS region 및 mature glucoamylase N-말단부위의 아미노산 98개와 B. subtilis 의 CMCase 구조유전자가 차례로 연결된 재조합플라스미드 pYESC24 를 제작한후 효모에 형질전환하였으나 CMCase 가 세포외로 분비되지 않았다. 반면에 STA1 의 TS region 및 mature glucoamylase N-말단 아미노산 98 개를 제거하여 CMMase 구조유전자갸 STA1 의 분비신호서열에 바로 연결된 재조합 플라스미드 pYESC11 에 의한 효모형질전환 균주는 CMCase 분비능이 아주 우수하였다. 이 형질전환 균주를 YPD 배지에서 4 일간 배양한 후 세포부위 별 CMCase 역가를 측정한 결과 배양액 1 m/당 총역가 44.7 unit 존재하였으며 이중 93% 이상이 배양상등액에서 관찰되었다.