Carboxydobacteria 를 위한 재조합 Plasmid 백터와 형질전환방법 개발

Carboxydobacteria 의 일산화 탄소 산화에 대한 유전학적 연구를 위해 Pseudomonas caarboxydovorans 에 존재하는 pYK100 plasmid 와 pBR322 를 이용하여 pYK322 (7.2 kb, Ap, Tc) 와 pYK324 (7.2 kb, Ap, Tc) 등 두가지 재조합 plasmid shuttle 백테를 만들고, pYK100와 pACYC184를 이용하여 pYK210(5.2 kb, $CM^{r}$ ), pYK220 (5.2kb,$CM^{r}$ ), pYK230 (5.2 kb, $Cm^{r}$ ), pYK232 (5.2 kb, $CM^{r}$) 등 네가지 shuttle 벡터를 만들었다. 재조합된 벡터들은 보두 대장균에서 안정되게 복제되었다. pYK322 와 pYK220 을 이용한 carboxydobacteria 의 형질전환 실험에서 Bagdasarian 과 Timmis 의 방법 (Curr. Top. Microbiol. Immunol., 96 :47-67, 1982) 을 변형하여 0.2% succinate 가 포함된 무기염류배지에서 지수성장 중기까지 배댜ㄷ한 세균을 이용하고, 형질전환용액의 10 mM RbCI 을 100 mM KCI 로 대체하며, 형질전환용액 처리후 4.deg.C 에서의 방치시간을 12시간으로 하고, DNA첨가휴 45.deg.C 에서 3 분간 heat shock 을 준 경우에 높은 형질전환이 일어났다. 형질전환된 세균으로 부터 형질전환에 사용한 plasmid 를 발견할 수 없었는데, 이는 도입된 plasmid 가 염색체 DNA 에 결합되었기 때문인 것으로 추측된다.

Recombinant plasmid shuttle vectors were constructed for genetic studies on the oxidation of carbon monoxide by carboxydobacteria. Two vectors. pYK322 (7.2 kb, Ap'. Tc') and pYK 324 (7.2 kb, Ap', Tc'), were constructed using pBR322 and pYK100. a small plasmid in Pseudomonas carbo,xydovorans. Four plasmids. pYK2IO (5.2 kb. Cm'), pYK220 (5.2 kb, Cmr), pYK230 (5.2 kb, Cm'), and pYK232 (5.2 kb. Cm'), were constructed using pACYC184 and pYK100. Transformation of several carboxydobacteria with pYK322 and pYK220 was round to be efficient when the cells were transformed by the methoti of Bagdasarian and Timmis (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96:47-67. 1982) with several modifications; cells growing on 0.2% succinate were harvested at the mid-exponential phase. 10 mM RbCl in transformation solution was substituted with 100 mM KCI. cclls in transformation solution were incubated for 12 h at 4'C before addition of DNA and heat shock was carried out for 3 min at 45$^{\circ}$C. Plasmid vectors used for transformation, however. were not detected from antibiotics-resistant transformants, suggesting that the vectors may be integrated into the chromosomal DNA.