Molecular Cloning and High-Level Expression of Human Cytoplasmic Superoxide Dismutase Gene in Escherichia coli

사람의 세포질 Superoxide Dismutase 유전자의 클로닝과 대장균내에서의 대량발현에 관한 연구

Complementary DNA (cDNA) coding for human cytoplasmic superoxide dismutase (SOD1) (superoxide: superoxide oxidoreductase E.C.1.15.1.1) was isolated from human liver cDNA library of $\lambda$gt11 by in situ plaque hybridization. The insery cDNA gas the 5' untranslational region (UTR) and 3'UTR of SOD1 gene. Polymerase Chain Reaction (PCR) method was used fro subcloning of SOD1 structural gene. Using synthetic sense strand primer (24mer) containing a start codon and antisense strand primer (24mer), SOD1 structural gene was selectively amplified. Amplified DNA was directly cloned into the HincII site of pUC19 plasmid. Insery cDNA was subcloned into M13 mp19 and sequenced by dideowy chain termination method with Sequenase. The nucleotide sequence of insert cDNA had an open reading frame (ORF) coding for 153 amino acid residues. The structural gene of cytoplasmic SOD was placed under the control of bacteriophage $\lambda P_{L}$ regulatory sequences, generating a highly efficient expression plasmid. The production of human SOD1 in E. coli cells was about 7% of total cellular proteins and recombinant human SOD1 possessed its own enzymatic acitivity.

생체내의 유해산소를 제거하는 superoxide dismutase (superoxide : superoxide oxidoreductase E.C.1.15.1.1) 중 세포질내에서 그 활성을 지니는 인체의 세포질 superoxide dismuta~ie (SODl) 유전자를 사람의 간 cDNA library로부터 동위원소로 표지된 oligonucleotide probe를 이용, in situ plaque hybridization 방법으로 선별 분리하여 내장균 벡터로 클로닝하였다. 이 클론은 SOD1 유전자의 5"L"TR과 3’UTR을 포함한 1.6 kb 정도의 cDNA였다 SOD1 구조유전자만을 선택적으로 분리하기 위해서 ATG를 포함하는 sense strand primer와 3’UTR 부위의 antisense strand primer를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 방법을 써서 SOD1 구조유전자 부위만을 선택적으로 증폭시켰다. Taq DNA polymerase에 의해 증폭된 DNA를 벡터 pUCl9의 multiple cloning site (MCS) 내의 Hinc II 위치에 넣였으며 이 insert DNA를 M13 mp19으로 옮겨 dideoxy chain termination 방법으로 sequenase를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 클론닝된 cDNA는 153개의 아미노산을 포함하고 있는 하나의 open reading frame (ORF)을 가셨다. 중합효소연쇄반응에 의해 이때 증폭된 SOD1 구조유전자를 $\lambda P_{L}$ 프로모터를 포함하고 있는 발현 벡터 pUPL에 옮긴 후 대장균에서 대량으로 발현시켰다. 이때 발현된 단백질 SOD1은 고유의 효소활성을 가지고 있었다.