면역화학적 방법에 의한 Acetobacter turbidans의 $\alpha$-Acylamino-$\beta$-lactam Acylhydrolase의 유전자 클론화

Molecular Cloning of the Gene for $\alpha$-Acylamino-$\beta$-lactam Acylhydrolase from Acetobacter turbidans by Immunochemical Detection Method

반합성 베타 락탐 항생물질의 가수분해 및 합성을 촉매하는 효소인 $\alpha$-acylamino-$\beta$-lactam acylhydrolase(ALAH)의 유전자를 Acetobacfer turbidans로부터 클론화하기 위한 연구를 수행하였다. 우선 순수 분리 정제된 효소에 대한 항혈청 (폴리클론 항체)을 제조한 다음 이를 probe로 하여 면역화학적 방법으로 유전자의 선별을 시도하였다. 이러한 용도로 개발된 운반체인 λ gtll에다 A. turbidans의 유전자 단편들을 삽입하여 genomic library를 제조한 후 이 library에서 유전자를 선별한 결과 두개의 positive clone을 얻을 수 있었다. 그러나. 이 두 clone들은 면역화학적으로 서로 다른 반응을 나타내었는데, 그 중 하나는 효소의 항혈청과는 잘 결합하나 융합되어진 베타 갈락토시다아제에 대한 항체와는 잘 결합하지 못하였고(λ gtll dn1), 또 다른 clone 은 이와 반대의 양상을 보여주었다(λ gtll dn2). 더구나 이들 clone을 여러 제한효소들로 분석해본 결과, 유전자가 삽입된 부분인 Eco RI 부위중 하나가 없어진 것을 알 수 있었다. 따라서 A. turbidans의 효소에 대한 유전자가 λ gtll에 클론화 되었으나 이 유전자와 베타 갈락토시다아제의 유전자(lacZ)간에 염기배열상 동위성이 있은 부위가 존재하여 재조합된 λ gtll 파지의 복제과정에서 삭제되어진 것으로 간주되어진다.

Molecular cloning of gene for $\alpha$-acylamino-$\beta$-lactam acylhydrolase (ALAH) III from Acetobacter turbidans has been attempted by immunochemical detection method, in which polyclonal antibody from mouse Balb/c against this enzyme was employed as a probe. As a cloning vector, λ gtll was chosen for this purpose. Two positive clones has been selected from genomic libraries of A. turbidans, which had somewhat different binding affinities on anti-ALAH III umm and anti-$\beta$-galactosidase. By restriction analysis, both clones has been turned out to lose one of EeoRI sites. From these results, it concluded that deletion of DNA between lacZ gene and inserted DNA has occurred during replication of these clones in host cells.