• 한국수정란이식학회지
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• 제21권2호
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• pp.137-146
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• 2006

본 연구는 공여 세포의 종류, 수핵 난자의 유래 및 수란 산양 발정 동기화 조건이 복제 산양 생산에 미치는 영향을 알아보고자 실시되었다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하였으며, 배란이 되지 않은 난포란은 난포로부터 흡입 채취한 후, 22시간 동안 체외 성숙을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 zona drilling 후, 극체와 세포질 일부분 제거를 통해 제핵을 실시하고, 핵이 제거된 난자의 위란강 내로 공핵 세포를 도입하여 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기 자극 방법으로 실시되었으며, 융합이 완료된 핵이식란의 활성화처리는 핵이식 3시간 후에 Ionomycin과 6-DMAP를 병용 처리하여 실시하였다. 복제 수정란의 체외배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 $2{\sim}4$ 세포기까지 체외 배양을 실시한 다음 수란 산양의 난관에 외과적으로 이식하였다. 임신 진단은 초음파 임신 진단기로 이식 후 제 30일과 60일에 실시하였다. 귀세포를 공핵 세포로 사용하였을 때 융합율이(63.8 VS. 26.5%) 태아 세포를 사용했을 때보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 총 102개의 복제 수정란을 20두에 이식하였으며, 30일에 4두(20.0%)가 임신하였으며 이중 1두가 1두의 복제 산양을 생산하였다. 수란 산양과 공란 산양간의 발정 동기화 간격(${\pm}0$ 또는 +12시간)별 수태율은 각각 18.2 및 16.7%로서 유의적인 차이가 없었다. 수란 산양의 발정 유기 방법에 따른 수태율에 있어서 CIDR 제거 후 hCG 및 PMSG를 투여하였을 때는 25%가 수태하였으나, hCG만 투여한 수란 산양은 수태가 되지 않아 인위적으로 발정 동기화된 수란 산양을 이용하였을 때는 산자를 생산하지 못했다. 자연 발정 산양의 경우, 발정이 동기화된(${\pm}0$) 수란 산양 1두에 체내 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산한 5 개의 복제 수정란을 이식하여 149일만에 국내에서 처음으로 복제 산양(진순이) 생산에 성공하였다. 체외 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산된 복제 수정란 5개를 이식하였으나 수태가 이루어지지 않았다. 이상의 결과로 볼 때 재래 산양의 체세포 핵이 식에 의한 복제 산자 생산에서 보다 효율성을 높이고 수태율을 향상시키기 위한 조건은 체내 성숙 난자를 수핵 난자로 이용하여 공란 산양과 발정이 동기화된(${\pm}0$) 자연 발정 수란 산양에 복제 수정란을 이식하는 것이 바람직한 것으로 생각된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.125-132
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• 2002

본 연구는 돼지 복제수정란의 생산성 향상에 기여하기 위한 기초연구로써 핵이식 수정란의 융합과 활성화 과정에 있어서 전기적 조건이 핵이식 수정란의 융합 및 체외발달에 미치는 요인들을 조사하기 위하여 실시하였다. 공여세포는 Landrace종의 귀 세포조직을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리하여 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 laser system으로 투명대를 drilling하여 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 전기적 자극으로 융합과 활성화를 실시하여 분할을 유도하였다. 분할이 이루어진 핵이식 수정란은 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 $CO_2$ 배양기에서 6~8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 발달을 유도하였다. 본 연구결과에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1.90kv/cm, 30$\mu$sec 1회의 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 핵이식 수정란의 융합율은 1.90kv/cm의 조건이 49.5%로써 2.10kv/cm(25.8%)와 2.50kv/cm(30.3%)의 조건보다 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 융합 후 활성화가 유기된 핵이식 수정란의 분할율은 2.50kv/cm 전기자극이 70.3%로써 가장 높게 나타났다. 핵이식 수정란을 30$\mu$sec 동안 1회와 2회의 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 융합율은 모두 50%였으며, 60$\mu$sec 동안 1회와 2회의 조건에서도 각각 58.4%와 50.8%로써 전기의 자극시간과 횟수에 따른 차이는 없었다. 융합이 이루어진 핵이식 수정란의 전기활성화 유도 후 융합시의 전기적 조건에 따른 분할율은 30$\mu$sec동안 1회와 2회에 있어서는 49.1%와 56.5%로써 차이가 없었으나, 60 $\mu$sec 동안 2회(76.3%) 실시하였을 경우에는 1회(56.1%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 높은 분할율을 보였다. 전기자극 후 융합이 이루어진 융합란의 분할율은 1.50kv/cm의 전기적 활성화 조건에서는 72.8%로써 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 단위발생란의 분할율 60.9%와는 차이가 없었다. 핵이식 수정란의 배반포기로의 발달율은 1.50kv/cm의 융합조건에서는 9.8%가 배반포기로 발달하였으나, 1.25kv/cm 조건에서는 배반포기로의 발달이 전혀 없었다. 단위발생란의 배반포기로의 발달율은 6.4%로써 핵이식란(1.5kv/cm)과 유의적(P<0.05)인 차이가 없었다. 이상의 결과를 볼 때 핵이식 수정란의 배반포기로의 발달은 융합 및 활성화 과정에 있어서 세포종류, 전기자극의 세기 및 통전시간 등이 영향을 미치는 것으로 생각되며, 돼지 핵이식 수정란의 전기적 융합조건은 1.90kv/cm, 60$\mu$sec., 2회, 융합란의 활성화 조건에 따른 배반포기로의 발달율은 1.50kv/m가 적합한 것으로 생각된다. 따라서 적정 전기적 융합 및 활성화 조건을 확립한다면 핵이식 수정란의 융합율과 체외발달율을 보다 더 높일 수 있을 것으로 생각된다.