접종근류균(接種根瘤菌)의 소장(消長)을 유전공학적(遺傳工學的)으로 조제(調劑)한 Bradyrhizobium japonicum RJB6 $str^rnal^rneo^r$을 이용(利用)하여 연구(硏究)하였다. 전남(全南)일대로 부터 분리(分離) 동정한 균(菌)에 먼저 streptomycin과 nalidixic acid에 저항성(抵抗性)을 갖는 spontaneous mutant를 유도하고 이어 pSUP2021를 함유(含有)하고 있는 E. coli와 conjugation하여 neomycin 저항성(抵抗性) gene(Tn5)을 도입(導入)하였다. Southern hybridization한 결과(結果) 4.9kb상에서 Tn5를 확인(確認)했다. 서로 다른 균밀도(菌密度)로 파종(播種)한 40일후, 크로로필을 제외한 근류수(根瘤數), 근류신선중(根瘤新鮮重), 간장 및 질소함량이 low cell suspension 처리구보다 heavy cell suspension 처리구에서 약간 높았다. 표식균주(標識菌株)의 회수율(回收率)은 heavy cell suspension 처리구에서 12%인 반면, low cell suspension 처리구에서는 5%에 지나지 않았다.
제주도내 양식넙치 병어에서 분리된 연쇄상구균 75균주의 항균제에 대한 감수성 경향 및 내성균 출현빈도를 조사하고 다재내성 균주로부터 전이성 R plasmid를 검출하였다. 넙치 병어에서 분리된 모든 연쇄상구균은 flumequine (AR)과 oxolinic acid (OA)에 대하여 저항성이었으며, 그 중 30균주 (41%)는 ampicillin (ABPC), doxycycline (DOXY), erythromycin (EM), norfloxacine (NFLX), oxyteracycline (OTC)의 약제에 대하여 다양한 조합으로 동시내성을 나타내었다. AR과 OA를 포함하여 4~6약제에 대하여 다재내성을 보인 균주는 26주였다. 연쇄상구균의 다재내성 전이에 관여하는 R plasmid인 pST9와 DNA구조가 유사한 plasmid의 분포를 알아보기 위하여 60 분리 균주에 대한 colony 혼성화를 실시하였다. 그 결과 13 분리균에서 혼성화 양성반응이 나타났으며 생사료의 원료로 사용되는 양치와 고등어에서도 양성반응이 나타남으로써 동일 DNA구조의 plasmid가 분포함을 시사하였다. 혼성화 양성반응을 보인 13균주로부터 전이성 R plasmid를 검출하기 위하여 conjugation을 실시하였다. OTC, DOXY, EM에 대한 항균제 내성 marker인 Otc, Doxy, Em은 R plasmid에 의하여 수용균인 Streptococcus sp.로 전이가 이루어졌다. 또한 이들 전이성 R plasmid를 보유하고 있는 연쇄상구균들이 동일 분류군에 속하는지를 알아보기 위하여 RAPD pattern을 분석하였다. 내성균주들의 RAPD pattern은 모두 유사하였으며, Streptococcus iniae type의 RAPD pattern (Kim and Kim, 2003)은 나타나지 않았다. 그러므로 pST9와 동일 DNA 구조의 R plasmid는 S. iniae에서의 출현빈도가 매우 낮을 것으로 예상되었다.
국내산 양앵두의 유용 생리활성 검토를 목적으로 양앵두 열수 추출물 및 순차적 유기용매 분획물을 조제하였다. 양 앵두 추출물의 약 40%는 당류 성분이었으며, 이의 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 분획효율은 각각 0.01%, 3.45%, 16.30% 및 80.24%로 나타나 양앵두 열수 추출물의 대부분이 부탄올 분획 및 물 잔류물로 이행되었다. 에틸아세테이트 분획물은 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 가장 높았으며, 물 잔류물은 34%의 총당을 함유하였다. 조제된 열수 추출물과 분획물의 항세균 활성을 평가한 결과 에틸아세테이트 및 부탄올 분획에서 Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, 및 Salmonella typhimurium에 대해 우수한 항세균 활성이 확인되었으며 (MIC, 0.5~1.0 mg/mL), Pseudomonas aeruginosa에는 항균 활성이 나타나지 않았다. 항Candida 활성은 헥산 분획에서만 확인되었으며, 항생제 내성균에 대해서도 우수한 항균 활성을 나타내었다(MIC, 0.5~1.0 mg/mL). 항산화능 평가의 경우 에틸아세테이트 분획에서 우수한 DPPH 소거능($IC_{50}:195.5\;{\mu}g/mL$) 및 환원력을 나타내었다. 본 연구결과는, 양 앵두가 우수한 항균 활성과 항산화 활성을 가진 유용한 과일자원으로 이용될 수 있음을 제시하고 있다.
면적 $26\;m^2$, 여과용 자갈 약 $15\;m^3$로 된 자갈 여과 장치에 연결된 단위면적 약 $7m^2$ 되는 사육탱크 6개와 보조탱크 2개로 구성된 장치에서 어류를 사육하면서 1980년 4월 18일부터 동 10월 14일까지의 180일간의 성장결과를 정리하여 본 결과는 다음과 같다. 1개의 사육탱크를 주실험용으로 사용했으며 이스라엘계 잉어와 이 종과 국내산 잉어 사이의 $F_1$ 잡종을 같은 수량씩 넣어 기른 결과는 총생산 461kg, 순생산 395kg였으며 그 중 이스라엘계 잉어는 약 8배로 성장했는데, $F_1$ 잡종은 약 6배로 성장했다. 남은 탱크에 수용한 잡다어류의 성장결과와 상기 생산량을 참작해 보니 이 시설을 보완개선해 가면서 이용하면 산업적 생산시도도 가능할 것으로 짐작된다. 특히 어류밀도가 높아졌을 때는 보다 효율적인 폭기방법을 이용함이 필요했다. 이 실험을 위해 만들어 사용한 부순환류이용의 고형오염물침전 제거장치는 용수절약을 위해서 효율적이며, 그 기능이 잘 발휘되었다. 가장 문제된 점은 아가미흡충의 심한 번식이었으며, Dipterex, DDVP 등의 사용으로 처음은 잘 제거되지만 곧 저항개체의 출현과 번식으로 이들 약품의 효력이 나타나지 않음을 알았다. 그리고, 이스라엘계 순종은 Dipterex 사용에 의해서 거의 대부분이 기형어로 되지만 $F_1$ 잡종 및 국내산 일반 잉어에는 기형어가 거의 나타나지 않았다.
충북, 충남, 강원도 일대에서 채취한 토양시료로부터 Bt 균주를 분리하고 이들 균주 중 세포내 내독소 단백질 결정체를 형성한 10개의 균주를 분리하여 균체생산수율과 살충력이 뛰어난 균주를 선발하기 위해서 배양 및 생물검정 시험을 수행하였다. 그 결과, 배추좀나방에 대한 살충력은 물론이고, 파밤나방과 담배거세미나방에 대한 살충력도 상대적으로 높고, 배추좀나방 저항성 계통에 대한 살충력이 우수하면서 균체량과 활성포자수가 많은 GB-413 균주를 최종 선발하였다. 선발된 균주의 상업적 생산 적용을 위해 배양특성 및 배양 공정 최적화 실험을 수행하였다. 탄소원인 초기 포도당 농도를 낮추어 포자형성이 유도되도록 배지조성을 변경하고 배양 중에 탄소원을 첨가하는 방식으로 배양공정을 변경한 결과, 포자형성율과 활성포자수가 증가하였고 포자형성시간 및 배양시간이 단축되었으며, 살충확성의 저하는 나타나지 않았다. 이렇게 최적화된 생산배지 및 공정을 5톤 발효조 배양에 최종 적용한 결과 유사한 배양결과를 얻어 상업화생산을 위한 대량배양의 가능성을 높여주었다.
간장의 발효에 지대한 영향을 미칠수 있는 고농도 식염내성 효모의 분리를 시도 했던바 발효기의 샘표간장덧 으로부터 6주의 효모를 분리선정하고 이들의 균학적성질을 살펴 동정함과 동시에 내염성및 간장의 풍미에 미치는 영향에 대하여 실험한 결과는 다음과 같다. (1) 고농도식염내성효모로 선정된 6주의 효모중 $T_3$균주는 Saccharomyces cerevisiae group II형, $T_5$와 $T_{11}$은 Debaryomyces nicotianae형, $T_8$은 Saccharomyces chevalieri형, $T_9$은 Saccharomyces rouxii형, $T_{10}$은 Saccharomyces rosei형으로 각각 동정 되었다. (2) 고농도의 식염 함유 배지의 경우 고체배지에서보다 액체배지에서 이들 효모의 내염성이 더욱 높았다. (3) 선정된 균주 모두가 무염배지에서 보다 $5{\sim}23%$의 식염함유 배지에서 잘생육하는 효염성의 효모들이였다. (4) $T_3,\;T_8,\;T_9,\;T_{10}$등의 균주는 배지의 식염농도 28%까지 생육하였으며 $T_5$와 $T_{11}$은 32%까지 생 육하였다. (5) 이들중 $T_9$의 균주가 Alcohol발효력이 가장 강했으며 발효생성물의 풍미도 가장 우수하였다. 또한 $T_5$와 $T_{11}$은 Mold취를 생성하며 산막을 형성하는 유해 효모였다.
에탄올을 생성하는 고농도 galactose 발효 효모 Saccharomyces cerevisiae No. 9를 선발하여 비교균주인 S. cerevisiae NRRL Y-1528과 함께 glucose, mannose, galactose에서 순치배양하고, 이어서 이들 3개의 탄소원을 기질로 사용하여 발효 효율을 평가하였다. 모균주인 No. 9의 에탄올 생산은 초기 12시간에는 천천히 상승하다가 18시간 후에 가장 높은 수준에 도달하였으며, 그 수율은 $[EtOH]_{max}/Sugar]_{ini}(g/g)$을 퍼센트로 환산하였을 때 glucose, galactose, mannose의 3개 기질에서 비교용 균주 NRRL Y-1528와 비슷한 36~38%로 수준이었고 실험한 3 균주 모두 galactose 발효에 있어서 탄소원의 종류에 따라 순치배양 조건이 에탄올 수율에 영향을 미치지 않았다. 전통적인 EMS 처리에 의하여 모균주인 galactose 발효성 효모 S. cerevisiae No. 9로부터 에탄올 발효력이 향상된 변이주 Mut-5 (SJ1-40), -17 (LK4-25) 및 -24 (LK2-48) 3개주를 선발하였다. 기질인 10, 15, 20% galactose를 이용한 에탄올 발효능을 실험 하였을때 모균주 No. 9 및 변이주에서도 galactose의 농도를 증가시킬수록 감소하는 경향을 나타내었다. Galactose 20% 농도에서 변이주는 모균주보다 에탄올 발효율이 39.9~51.6% 높았으나, 비교용 균주 S. cerevisiae NRRL Y-1528의 에탄올 발효력에는 미치지 못하였다.
국내 육성 추파 품종인 '영산' 유채의 자엽 부착 잎자루 부위를 이용하여 재분화와 형질전환의 효율 증진에 영향을 주는 요인을 살펴보았다. 줄기 형성율은 NAA 0.5 mg/L와 Kinetin 2~4mg/L가 혼용 첨가된 배지에서 61~71%로 가장 양호하였다. 또한 질산은(Silver nitrate) 5~9 mg/L 첨가는 재분화에 필수적이었고, $GA_3$ 0.01 mg/L 첨가는 재분화에 긍정적인 영향을 주는 것으로 관찰되었다. 아그로박테리움의 Strain 종류, 공동배양 시간, 그리고 형질전환체 초기 선발시 항생제 농도 조절(저${\rightarrow}$고농도)에 따른 '영산' 유채의 형질전환 효율을 살펴본 결과, 아그로박테리움의 Strain 선정이 가장 중요한 요인으로 조사되었다. 특히, EHA105 succinamopine strain을 사용하였을 때 형질전환 효율이 26.8%로 가장 효과적이었다. Bar 유전자와 GUS 유전자가 내재된 형질전환체는 제초제 '바스타' 살포시 생존하고, X-Gluc으로 염색되었다. 그리고 Southern 분석을 통해 후대로 유전자가 안정적으로 유전됨을 확인하였다.
B. polyfermenticus SCD와 상업적으로 사용되는 생균제들의 pH 2.0, 3.0에서 내산성을 비교한 결과, 2시간에서의 생존율은 pH 2.0, 3.0에서 각각 85.6과 92.6%의 생존율을 나타내었으며 4시간에서도 각각 62.8%와 81.2%의 높은 생존율을 나타내었다. B. polyfermenticus SCD의 인공담즙산에 대한 내성을 확인한 결과, 인공담즙산이 함유되지 않은 대조구($3.2$\times$10^{7}$ CFU/ml)보다 균수($6.5$\times$10^{7$ CFU/ml)가 더 많이 증식되었다. 또한 B. polyfermenticus SCD는 비타민 $B_1$, $B_2$를 생산하고 장내유해균웨 의한 비타민 B군의 분해를 억제하여 영양을 공급한다. 게다가 비타민 C를 다량 생산하여 공급하므로 비타민 C의 항산화작용에 의한 피부노화 방지 및 항암작용 등의 여러 가지 효능들도 기대할 수 있다. B. polyfermenticus SCD의 소화력을 다른 Bacillus sp.과 비교했을 때 지방소화력은 비슷한 활성을 나타내었으나, 전분 소화력은 약 2배, 단백소화력은 약 25배의 높은 소화력을 가지고 있었다. B. polyfermenticus SCD는 낮은 pH에서도 안정성이 확보되었으며 저장온도는 가혹조건($40^{\circ}C$, RH 70%)에서 26.8%거 비교적 낮은 안정성을 나타내었을 뿐 저온 및 실온에서는 매우 안정하였다. 그리고 수중에서와 5% glucose용액, 고농도의 NaCl 에서도 매우 높은 안정성을 나타내어 식품을 포함한 다양한 형태의 제품에 적용했을 때에도 그 안정성이 탁월하여 응용성이 크다고 할 수 있겠다. B. polyfermenticus SCD복용에 따른 장내균총의 변화에서는 Salmonella, E. coli, Staphylococcus등 유해균의 유의성 있는 감소효과를 나타내었으며, 유익균과의 공생작용과 유익균에 대한 생육촉진작용을 나타내었다. 장내 암모니아의 변화에서는 복용 중에 유의성 있는 감소효과를 보였다. 이상의 결과로서 B. polyfermenticus SCD의 생균제로서의 특성은 기능성 식품의 개발 등 산업적으로 매우 유용하다고 판단된다.
항생물질에 대한 다중 저항성을 갖는 Staphylococcus aureus 균주의 chromosomal DNA로부터 유발성 발현을 하는 ${\beta}$-lactamase(bla) 유전자를 확인, 분리하였다. Cloning에 이어 결정된 염기서열을, S. aureus 에서는 지금까지는 plasmid상에서만 분리, 보고되어 있는 bla 유전자들의 염기서열과 비교하였다. 본 bla 유전자의 구조유전자 부분인 843base의 염기서열은 기 발표된 pPC1, pl258, pS1, pI1071, pUB101, pl3796 및 pI3804 유래의 bla 유전자들 중 pPC1, pI258 및 pS1상에 존재하는 bla 구조유전자의 염기서열과 완전히 일치하였고 나머지 것들과도 매우 높은 상동성(99%)을 유지하고 있었다. Bla구조 유전자의 상류 370base 및 하류 220base까지 결정된 염기서열을 비교한 결과에서는 다른 모든 bla구조유전자의 상류 150base에 위치하는 HindIII 인식부위가 약 230base 이상 더 윗쪽으로 옮겨가 있었고 이 HindIII 인식부위를 포함하는 염기서열에서 ORF의 C말단이 발견되었다. 하류 서열에서는 pI1071 유래 bla가 갖는 두개의 직접반복 염기서열 중 하나가 결손된 형태를 보이고 있다. 구조 유전자 상류에 존재하는, 80개 아미노산으로 구성된 ORF의 상동성 검색 결과 Tn4001 의 transposase 의 C 말단과 일치함이 발견되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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