• 대한수의학회지
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• 제40권1호
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• pp.86-93
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• 2000

Paratuberculosis (Johne's disease), a chronic enteritis produced by Mycobacterium paratuberculosis, affects a large proportion of ruminants in all continents and causes important economic losses. The identification of well-characterized and species-specific components of M paratuberculosis would provide the means to improve the specificity and sensitivity of immunodiagnostic assays for Johne's disease. The aims of this study were to express the recombinant C-terminal of 34kDa protein (rC34P) of M paratuberculosis in E coli and to investigate the effectiveness of this protein in detecting antibodies to the native protein in sera from paratuberculosis infected cattle. The C-terminal of the gene encoding the 34kDa protein was amplified by polymerase chain reaction from the chromosomal DNA of M paratuberculosis (ATCC 19698) and cloned into vector pGEX-4T-2. Then, cloned plasmid was transformed into E coli DH5${\alpha}$ and the rC34P was overexpressed. The rC34P was purified by affinity chromatography and gel filtration. The rC34P was examined antigenicity by Western blot. The rC34P was reactive with culture positive bovine serum and hyperimmune rabbit anti-M paratuberculosis serum but was not reactive with culture negative bovine serum and tuberculin positive bovine serum in Western blot. In conclusion, the rC34P produced in this study is expected as a useful candidate for antigen in serological diagnosis of Johne's disease.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제29권1호
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• pp.1-8
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• 1991

스파르가눔 생리식염수 추출액 내에 포함되어 있는 성분단백질 중 스파르가눔증 환자 혈청내 특이 IgG항체와 민감하고 특이하게 반응하는 항원단벼질인 36, 29 kDa단백질을 단세포군 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그 래피로 순수분리할 수 있음은 이미 보고하였다. 이 연구에서는 스파르가눔 추출액 내에 포함된 이 36, 29 kDa단백질이 젤라틴을 고리로 한 친화성 크로마토그래피로 훨씬 쉽게 순수분리할 수 있음을 증명하고자 하였다. 젤라틴을 고리로 부착시킨 Sepharose 4B column에 스파르가눔 추출액을 통과시키고 젤라틴에 부착한 단백질은 4 M urea/0.1M NaCl 용액을 분리완충액으로 분리하였다. 이렇게 분리한 단백질은 SDS-PAGE에서 36, 29 kDa band로 구성되어 있었고, SDS-PAGE/immunoblot 결과 환자의 polyclonal 항체는 이들 band에만 반응하였다. 스파르가눔증, 기타 기생충증 환자 및 건강대조군 혈청내 스파르가눔 특이항체가(IgG)를 면역효소측정 법으로 측정 한 결과 순수분리한 이 단백질은 특히 특이도가 95.8%로 생리식염수 추출액의 89%보다 우수하였고 민감도는 차이가 없었다. 이상의 결과는 젤라틴을 고리로 이용한 친화성 크로마토그래피는 스파르가눔 생리식염수 추출액 내의 36 및 29 kDa 단백질을 간편하게 순수분리할 수 있고 단백질의 항원성도 유지할 수 있음을 보이고 있었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제34권2호
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• pp.135-142
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• 1996

톡소포자충(Toxoplosma gondii) 주요막단백질의 하나인 30 kDa 단백질(p30)의 항원부위를 결정하고자 p30의 아미노산 분석에 따른 친수성 부위 및 혐수성 부위에 맞게 유전자를 증폭하고 발현시켜 항원성을 검토하였다 p30의 절편으로는 p30 전체 p30의 N-말단 Signal Sequence와 C- 탈단의 혐수성 부위를 제거한 S28. S28의 N-말단 2/3부위인 Al9. S28의 C-말단 2/3부위인 Pl9. 528의 N-탈난 1/3부위인 X9 중앙 1/3부위인 Y10 및 C-말단 1/5부위인 Z9로 구성하였다. 각절편에 대한 primer에는 EcoR I의 clampsequence를 포함시켜 중합효소반응으로 증폭시켰으며 G57를 발현하는 pGEX-4T-1 vector에 삽입시킨 후 Eschericha coli(.JM105 strain)에 형질변형시키고 IgG로 각 절편이 GST와 융합단백질로 발현되도록 하였다 SDS-PAGE상에서 p30은 63 kDa. S28는 54 kDa Al9과 Pl9은 각각 45 kDa. X9은 35 kDa. Y10은 36 kDa 및 29은 35 kDa 단백질로 발현되었다. 각각의 단백질은 westemblot상에서 GSTdetectionkit와 잘 반응하여 융합단백질임을 확인하였다. 톡소포자충증 환자 혈청과 westem blot에서 p30. S28 및 Al9은 반응하여 항원성이 인정되었으나 Pl9 . X9, Y10 및 Z9는 반응하지 않았다 따라서. p30의 중간 1/3 부위의 존재하에 N-말단 1/3부위가 항원성을 나타내는 구조적 항원이거나. 첫 1/3부위와 중 간 1/3부위의 경계에 위치한 polypeptide가 항원성을 발현하는 것으로 추정되었다.

• 한국식품과학회지
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• 제32권4호
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• pp.959-963
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• 2000

콩은 우유, 계란과 더불어 우리나라에서 과민성 알레르기를 일으키는 대표적인 식품중의 하나로 손꼽힌다. 이에 본 연구에서는 콩에 알레르기 반응을 일으키는 환아의 혈청과 콩 단백질을 토끼에 면역하여 얻은 다클론 항체를 이용하여 immunoblotting 및 ELISA 방법을 통하여 가열 처리한 콩과의 반응성을 조사 함으로서 가열처리가 콩의 항원성 내지는 알레르기성에 미치는 영향을 조사하였다. 물중탕으로 1 시간까지 가열처리 후 SDS-PAGE에 의해 분리된 콩 단백질은 열처리에 따른 콩 단백질 band의 변화를 관찰할 수 없었다. 또한 다클론 항체와의 반응성 확인을 위한 immunoblot 방법에서도 열처리에 따른 반응성의 차이는 나타나지 않았으며 콩 알레르기 환자의 혈청 역시 가열 처리에 따른 콩과의 반응성의 차이가 ELISA법을 이용한 측정에서 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 부터 콩 알레르겐의 항원성 및 알레르기성은 가열처리에 의해 변화되지 않음을 확인할 수 있었다.

• 대한임상검사과학회지
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• 제48권4호
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• pp.371-377
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• 2016

탈회방법은 골수조직의 병리학적 진단을 위해서 항상 시행되는 과정이다. HCl 탈회용액과 같이 주로 사용하고 있는 산성용액은 탈회과정 동안에 조직내의 항원성에 손상을 입힌다. 특히, 골수조직 내의 RNA나 DNA에 심하게 손상을 준다. 따라서 조직의 항원성을 보존하기 위한 표준화된 탈회방법이 필요하다. 본 연구는 일반적으로 가장 많이 사용되는 HCl 기반의 상품화된 탈회용액과 직접 제조한 EDTA 탈회용액이 골수조직의 탈회과정에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다. 환자로부터 채취된 73예의 골수생검조직을 HCl 탈회와 EDTA 탈회의 두 그룹으로 나누어 탈회과정을 진행하였다. 골수생검조직의 탈회과정 후 결과의 차이는 hematoxylin & eosin 염색과 reticulum 염색, Ki-67, CD20, CD138의 항체를 이용한 면역조직화학염색, DNA 추출 및 분석, in situ hybridization, IGH gene rearrangement 와 같은 분자병리검사를 시행하여 분석하였다. 일반적인 염색과 특수염색에서는 두 탈회용액간의 차이는 없었다. 또한 세포증식 표지자와 같은 세포막 혹은 세포질에서 발현되는 항체는 탈회용액간의 차이 없이 잘 염색되었다. 반면 HCl 탈회 용액에 처리한 후 핵 내 단백질인 Ki-67의 염색상은 현저히 불량한 것으로 관찰되었다. HCl 탈회용액과 비교하여 EDTA 탈회용액에서의 골수생검조직 내의 DNA와 RNA가 잘 보존되었음을 다양한 분자병리검사를 통해 확인할 수 있었다. 특히 HCl 탈회용액에 처리한 28예와 EDTA 탈회용액에 처리한 12예의 DNA의 순도와 농도을 비교한 결과 통계학적으로 유의한 수준으로 차이가 있음을 확인하였다. 이로써 EDTA 탈회용액이 조직 내의 항원성을 잘 유지시키며, 면역조직화학염색과 분자병리검사에 적합한 방법임을 확인 할 수 있었다.

• 한국식품과학회지
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• 제40권5호
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• pp.568-573
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• 2008

난백의 알레르겐을 감소시키기 위해서 여러 가지 처리를 실시하고 처리난백의 알레르기성의 변화를 평가하고자 passive cutaneous anaphylaxis(PCA) test, immunoblot, 생쥐모델에 의한 알레르기 유발시험을 실시하였다. PCA test결과 열처리($121^{\circ}C$, 30 min)한 난백은 처리하지 않은 난백에 비하여 그 항원성이 1/8 정도로 감소되었으며, NaOH처리군은 0.3%와 1%에서 각각 1/4, 1/8로 항원성의 감소를 보였다. 특히, NaOH처리 후 열처리(70oC, 15 min)를 추가적으로 복합처리한 난백의 경우, NaOH 0.3%(w/v)에서는 1/8 정도로, NaOH 1%(w/v)에서는 1/32 정도로 강력하게 항원성이 감소되었다. 계란 알레르기 환자의 IgE 항체를 이용하여 immunoblot을 실시한 결과 121oC로 열처리한 시료에서 난백의 주요 단백질 band가 흐려지는 것으로 나타났고 NaOH와 열로 복합처리한 난백의 경우에도 NaOH 0.1%(w/v) 이상에서 band들이 대부분 소실되는 것으로 나타났다. 생쥐모델에 의한 시험을 실시한 결과, 난백으로 유도한 전신알레르기 증상의 평균점수는 1.85이었으나 복합처리한 난백의 경우 그 점수가 0.20로 현격하게 감소되었다. 결론적으로, 상기 3종의 시험에서 공통적으로 가장 효과적인 난백의 알레르기성 저감화 방법은 복합처리(NaOH(1%, w/v) 및 열($70^{\circ}C$, 15min))임이 확인되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제51권4호
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• pp.276-280
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• 2008

식품 allergen 저감화 수단으로 자외선 조사의 타당성을 검토하고 자외선조사가 식품 단백질의 분자적 성질에 미치는 영향을 조사하고자 ovalbumin 용액에 자외선을 조사한 후 단백질의 분자량 분포와 2차구조 및 3차구조의 변화를 조사하였다. SDS-PAGE와 Gel permeation chromatography 결과 ovalbumin은 자외선 조사에 의하여 단백질이 분해되고 조사시간이 증가할수록 펩티드가 중합하는 형태를 나타냈다. Circular dichroism 연구는 자외선 조사에 의하여 ${\alpha}$-helix 구조가 감소하고 조사시간이 증가할 경우 compact denatured ovalbumin의 구조를 나타내는 2차구조의 변화를 나타냈다. 자외선 조사된 ovalbumin의 형광스펙트럼은 조사시간이 증가할수록 단백질의 maximum emission intensity가 감소하는 3차구조의 변화를 나타냈다. 결과적으로 자외선 조사는 ovalbumin의 분자적 성질을 변화시키며 allergen의 항원성을 변화시키는 수단으로 이용가능성을 시사한다.

• 대한바이러스학회지
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• 제27권2호
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• pp.151-160
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• 1997

In view of the potential of replicase protein as a diagnostic reagent for human caliciviruses (HuCVs), we have cloned and over-expressed this gene from the Snow Mountain-like Korean strains in Escherichia coli as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST), and described the preliminary antigenic characterization of the recombinant products. Each 470bp fragment corresponding to highly conserved region of RNA-dependent RNA polymerase was generated by RT-PCR from stools of two diarrheal children, cloned in pMOSBlue T-vector, and subcloned between the EcoRI and SalI restriction sites of pGEX-4T-3, a GST gene fusion vector, yielding $pGCV_{pol}$. This construct expressed a Snow Mountain-like HuCV replicase under the control of the IPTG-inducible tac promoter. An extract prepared by sonication of the E. coli cell inclusion bodies bearing $pGCV_{pol}$ products was purified and analyzed by SDS-PAGE. After Coomassie blue staining, it was shown that the recombinant replicase migrated on the gels with an approximate molecular mass of 46.5 kDa, that was subsequently cleaved into a 26 kDa GST fragment and a 20.5 kDa replicase protein upon digestion with thrombin protease. The replicase was recognized on immunoblotting with the sera from symptomatic children with the HuCV-associated diarrhea but not by asymptomatic sera from adults. The results presented the first biological activity of individually expressed HuCV replicase subunit and provided important reagents for diagnosis of HuCV infection.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제39권1호
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• pp.57-66
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• 2001

In the course of immunoscreening of Clonorchis sinensis cDNA library, a cDNA CsRP12 containing a tandem repeat was isolated. The cDNA CsRP 12 encodes two putative peptides of open reading frames (ORFs) 1 and 2 (CsRP12-1 and -2). The repetitive region is composed of 15 repeats of 10 amino acids. Of the two putative peptides, CsRP12-1 was proline-rich and found to have homologues in several organisms. Recombinant proteins of the putative peptides were bacterially produced and purified by an affinity chromatography Recombinant CsRP12-1 protein was recognized by sera of clonorchiasis patients and experimental rabbits, but recombinant CsRP 12-2 was not. One of the putative peptide, CsRP12-1, is designated CsPRA, proline-rich antigen of C. sinensis. Both the C-termini of CsRP12-1 and -2 were bacterially produced and analysed to show no antigenicity. Recombinant CsPRA protein showed high sensitivity and specificity. In experimental rabbits, IgG antibodies to CsPRA was produced between 4 and 8 weeks after the infection and decreased thereafter over one you. These results indicate that CsPRA is equivalent to a natural protein and a useful antigenic protein for serodiagnosis of human clonorchiasis.

• BMB Reports
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• 제38권6호
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• pp.717-724
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• 2005

The nontoxic B subunit of cholera toxin (CTB) can significantly increase the ability of proteins to induce immunological tolerance after oral administration, when it was conjugated to various proteins. Recombinant CTB offers great potential for treatment of autoimmune disease. Here we firstly investigated the feasibility of silkworm baculovirus expression vector system for the cost-effective production of CTB under the control of a strong polyhedrin promoter. Higher expression was achieved via introducing the partial non-coding and coding sequences (ATAAAT and ATGCCGAAT) of polyhedrin to the 5' end of the native CTB gene, with the maximal accumulation being approximately 54.4 mg/L of hemolymph. The silkworm bioreactor produced this protein vaccine as the glycoslated pentameric form, which retained the GM1-ganglioside binding affinity and the native antigenicity of CTB. Further studies revealed that mixing with silkworm-derived CTB increases the tolerogenic potential of insulin. In the nonconjugated form, an insulin : CTB ratio of 100 : 1 was optimal for the prominent reduction in pancreatic islet inflammation. The data presented here demonstrate that the silkworm bioreactor is an ideal production and delivery system for an oral protein vaccine designed to develop immunological tolerance against autoimmune diabetes and CTB functions as an effective mucosal adjuvant for oral tolerance induction.