• 농업과학연구
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• 제25권1호
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• pp.79-88
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• 1998

본 연구는 축협중앙회 한우개량부에서 사육중인 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하여 한우의 면역체계에 중요한 역할을 담당하고 있는 BoLA DRB3 exon2 유전자를 PCR기법을 이용하여 증폭하고 친자확인을 위한 이들 대립유전자들의 염기서열을 분석하여 한우의 효율적인 육종에 분자유전수준에서의 접목을 위한 기초자료를 얻고자 실시하였던바, 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1 한우의 혈액에서 추출된 genomic DNA를 1.5% agarose gel에서 전기영동한 결과, 12.2kb이상의 단일밴드로 나타나, genomic DNA는 아주 잘 분리된 것으로 판단되었으며, 한편 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 BoLA DRB3 exon2 유전자를 증폭한 결과 284kb의 단편이 증폭 되었음을 확인하였다. 2. PCR 증폭산물을 pCR 2.1 vector를 사용하여 cloning 하고, 균주에 형질전환을 시켜 재조합 plasmid를 추출한 후, EcoR 1으로 처리한 결과 300bp 단편이 확인되어 증폭되어진 BoLA DRB3 exon2 유전자가 vector 내에 잘 삽입되었음을 확인하였다. 3. 부와 모의 BoLA DRB3 exon2 대립유전자의 염기서열을 분석한 결과 염기서열의 상동성은 부의 대립유전자간에는 82.0% 이었고, 모의 대립유전자간에는 90.1%이었다. 4. 친자를 확인하기 위해 부와 모 그리고 자손간의 가계에 대한 BoLA DRB3 exon2 대립유전자의 염기서열을 분석한 결과 Mendel 의 법칙에 따라 유전된다는 사실을 확인 할 수 있었다. 5. 이상의 결과를 종합하여보면 한우의 BoLA DRB3 exon2 유전자의 부와 모, 그리고 자손의 대립유전자에 대한 염기서열 수준에서의 친자확인이 가능하였으며, 이들 연구결과는 축우의 유전적 능력개량에 중요한 분자유전학적 기초 자료가 될 것으로 판단되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권2호
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• pp.122-129
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• 1998

최근 생물방제균으로 주목받고 있는 Enterobacter cloacae의 방제기작이 이 균에 의해 토양내에서 생산된 휘발성 ammonia이며 ammonia의 생산에는urease가 관계한다는 보고를 근거로 하여, 항생물질 생산성 균주로 선발된 우수한 길항균주에 암모니아 생성능, 즉 urease 유전자를 유전적으로 부가함으로써 항진균성 길항물질 생산과 암모니아 생산이 동시에 이루어 질 수 있는 새로운 다기능의 생물방제균을 유전적으로 육종하고자 하였다. 저병해 인삼경작지로부터 식물근부균 Fusarium solani의 생육을 강하게 억제하는 길항세균 한 균주 SH14균주를 분리, 선발하였으며, 분리된 균주를 동정한 결과 Bacillus subtilis이거나 그 근연종으로 추정되었다. 억제기작 실험을 통해 길항균주 B. subtilis SH14에 의해 생산되는 항진균성 길항물질은 외막가수분해효소와 같은 고분자 물질이 아니라 열에 안정한 저분자의 항생물질임을 알 수 있었다. 한편 ammonia 생산을 위한 urease의 유전자는 urease 생산력이 강력한 호알칼리성 Bacillus pasteurii의 urease 생산유전자를 E. coli-Bacillus shuttle vector인 pEB203에 subcloning하였고, 이어서 pGU 366으로 명명된 이 recombinant plasmid를 선발된 항진균성 길항균주 B. subtilis SH14에 PEG-induced protoplast transformation 방법으로 도입, 발현시켰으며, 최적조건을 조사하여 90분간의 lysozyme 처리과정 후 1.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 DNA와 40% PEG4000의 첨가로 약 6.5$\times$$10^{-4}$의 형질전환율을 얻을 수 있었다. 아울러 암모니아 생성능이 부가된 생물방제균 B. subtilis SH14(pGU366)에 의해 식물근부균 F. solani에 대한 생육억제력이 증가되는지 여부를 억제거리 측정법과 균체중량법을 통해 확인한 결과 urease 유전자가 도입된 형질전환체 B. subtilis SH14(pGU366)의 근부균 생육억제능이 각각 36.7%, 44.0%정도로 숙주균주인 B. subtilis SH14에 비해 근부균 생육억제능을 보다 강하게 나타내었음을 알 수 있었다. 따라서 항진균성 항생물질 생산성 생물방제균 B. subtilis SH14에 외부의 urease유전자를 도입하여 ammonia 생성능을 부가함으로써 생물방제력의 상승효과를 거둘 수 있었다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제23권3호
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• pp.292-301
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• 2010

Follicle-stimulating hormone (FSH) is a pituitary glycoprotein hormone that is encoded by separate alpha- and betasubunit genes. It plays a key role in stimulating and regulating ovarian follicular development and egg production in chicken. FSH signal transduction is mediated by the FSH receptor (FSHR) that exclusively interacts with the beta-subunit of FSH, but characterization of prokaryotic expression of the FSHb gene and its effect on the expression of the FSHR gene in local chickens have received very little attention. In the current study, the cDNA fragment of the FSHb gene from Dagu chicken was amplified using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and inserted into the pET-28a (+) vector to construct the pET-28a-FSHb plasmid. After expression of the plasmid in E. coli BL21 (DE3) under inducing conditions, the recombination protein, $FSH{\beta}$ subunit, was purified and injected into the experimental hens and the effect on the mRNA expression levels of the FSHR gene was investigated. Sequence comparison showed that the coding region of the FSHb gene in the local chicken shared 99%-100% homology to published nucleotides in chickens; only one synonymous nucleotide substitution was detected in the region. The encoded amino acids were completely identical with the reported sequence, which confirmed that the sequences of the chicken FSHb gene and the peptides of the $FSH{\beta}$ subunit are highly conserved. This may be due to the critical role of the normal function of the FSHb gene in hormonal specificity and regulation of reproduction. The results of gene expression revealed that a recombinant protein with a molecular weight of about 19 kDa was efficiently expressed and it was identified by Western blotting analysis. After administration of the purified $FSH{\beta}$ protein, significantly higher expression levels were demonstrated in uterus, ovary and oviduct samples (p<0.05). These observations suggested that the expressed $FSH{\beta}$ protein possesses biological activity, and has a potential role in regulation of reproductive physiology in chickens.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제46권3호
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• pp.315-324
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• 2004

본 연구는 돼지에서 특이적으로 만들어지는 것으로 알려진 19-nortestosterone(nandrolone) 및 여성호르몬(estrogen)의 합성에 관여하는 효소인 Cytochrome P450 aromatase에 대한 유전자의 발현 양상을 밝혀내기 위해 실시되었다. RT-PCR과 최근에 개발된 DHPLC(Denature High Performance Liquid Chromatography 또는 WAVE라고 함) 분석 장치를 이용하여 정소와 난소에서 어떤 isoform의 aromatase 유전자가 발현되는지에 관해 조사하였다. 이러한 방법을 통해 같은 양의 RNA 중에 존재하는 정소내 aromatase mRNA가 난소보다 상대적으로 많이 존재한다는 것이 밝혀졌으며, 이는 돼지의 경우 수컷이 암컷 보다 혈중 여성호르몬이 더 높게 나타난다는 이전의 연구 발표가 돼지에서 여성호르몬을 만드는 aromatase 유전자가 난소에 비해 정소에서 더 많이 만들어지기 때문이라는 사실을 입증하였다. 또한, 정소와 난소에서 발현되는 aromatse 유전자를 PCR를 이용하여 증폭한 후 DHPLC를 이용하여 분석한 결과 type II, III와 다르다는 것을 확인하였다. RT-PCR에 의해 증폭된 aromatase DNA 단편을 plasmid vector에 cloning한 후에 그 염기 서열을 분석한 결과, 정소 및 난소에서 발현되는 aromatse는 모두 type I(난소형)으로 밝혀졌다. 이는 어떻게 정소와 난소의 두 다른 조직에서 같은 aromatase 효소로부터 다른 steroid가 만들어 질 수 있는지에 대한 새로운 의문을 제시하는 연구결과이며, 현재 추가적인 연구가 진행 중이다. 또한, DHPLC 기술을 활용하여 염기서열이 매우 유사한 isoform 유전자들의 발현을 관찰할 수 있다는 사실이 증명되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권6호
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• pp.479-485
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• 1986

Bacillus amyloliquefaciens가 생성하는 액화형 $\alpha$-amylase의 구조유전자를 클로닝하기 위하여 이 균주 염색체의 2 - 5kb 획분을 분리하여 Mbo I으로 부분분해한 후 pUB110플라스미드의 BamHI 부위에 삽입하여 hybrid vector pSKS3 를 제작하였다. 이 재조합플라스미드를 세한수식결손 세포인 Bacillus subtilis ED 107에서 subcloning한 후 당화형 $\alpha$-amylase를 생성하는 Bacillus subtilis NA 64의 $\alpha$-amylase결실변이주 Bacills subtilis KM 107 주에서 형질 발현시켰다. 이때 형질전환빈도는 $10^{-5}$ - $10^{-7}$정도였으며 그중 약 50%가 $\alpha$-amylase 분비능이 있었으나 거의 대부분이 쉽게 실활되었다. 최종선별과정에서 $\alpha$-amylase를 가장 강하게 생성하는 형질전환주 Bacillus subtilis KM213으로부터 재 추출한 재조합플라스미드 pSKS3는 5.7kb 삽입된 단편이 BamH I/Mbo I 부위에 결합되어 있었다. pSKS3에 클로닝된 유전자에 의해 발현되는 $\alpha$-amylase 활성은 B. amyloliquefaciens 활성의 약 25%였으며, 이 pSKS3에 의해 발현되는 $\alpha$-amylase 단백은 B.amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase와 동일한 전기영동성을 나타내었음을 볼 때 pSKS3에 클로닝된 유전자는 B. amyloliquefaciens에서 유래함을 알 수 있었다.

• 대한바이러스학회지
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• 제26권1호
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• pp.77-90
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• 1996

Nucleocapsid protein (NP)which exists in the particle of hantavirus and surrounds the viral RNA genome is one of the major structural proteins and plays role of antigen to elicit the antibody detected predorminantly right after infection of the virus in the patients of hemorragic fever with renal syndrome (HFRS)or experimental animals. NP is important target antigen in serological diagnostic system of HFRS utilizing whole antigens from the native virus particle, such as IFA, ELISA and Western blotting. Therefore, the preparation of this protein in the level of higher quantity and purity is desirasble for developed dianosis of the disease. The purpose of this study is the cloning of NP gene which exists in the S genome segment of Maaji (MAA) virus and expression of the gene to obtain qualified, genetically engineered NP to be utilized as an immunodiagnostic antigen. First of all, for the purpose of amplifing the MAA-NP gene by PCR, the specific primers were built from the known nucleotide sequence of Hantaan viral NP gene. The viral cDNA of the NP gene was synthesized by using the primers and RNase $H^-$ AMV reverse transcriptase. Thereafter, using this cDNA as a template, the NP gene was amplified specifically by Taq DNA polymrerase. The pT7blue (R)T-overhang vector systems were used for cloning of the amplified NP gene. The expression system was consisted of BL21 (DE3)pLysS and pET16b as a host and a plasmid repectively. Into Ndel site of pET16b, NP gene was ligated with cohesive end for the expression. Insertion of NP gene in the plasmid was confirmed by PCR and mini prep methods. For expression, IPTG was used and the expressed protein was characterized by Western blotting. The MAA-NP was expressed as the form of inclusion body (insoluble fraction)and the protein purified by affinity and metal chealating columns reacted specifically with the sera from patients of HFRS as to be tested by ELISA and Western blotting.

• 대한미생물학회지
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• 제35권3호
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• pp.263-271
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• 2000

A clinical isolate of Klebsiella pneumoniae K7746 produced the extended-spectrum ${\beta}$-lactamase (ESBL) SHV-12. A 6.6 kb BamHI fragment containing the $bla_{SHV-12}$ gene of K7746 strain was cloned into pCRScriptCAM vector resulting in the recombinant plasmid p7746-Cl. The restriction map of 3.6 kb inserted DNA and sequences immediately surrounding $bla_{SHV-12}$ of p7746-C1 were homologous to plasmid pMPA2a carrying $bla_{SHV-2a}$. In addition, both $bla_{SHV-12}$ and $bla_{SHV-2a}$ were expressed from a common hybrid promoter made of the -35 region derived from the left inverted repeat of IS26 and the -10 region from the $bla_{SHV}$ promoter itself. The results indicate that $bla_{SHV-12}$ and $bla_{SHV-2a}$ may have evolved from a common ancestor in the sequential order of $bla_{SHV-2a}$ first, followed by $bla_{SHV-12}$. Furthermore, by the PCR mapping method using primers corresponding to the IS26 and $bla_{SHV}$, the association between IS26 and $bla_{SHV}$ was studied in 12 clinical isolates carrying $bla_{SHV-2a}$, 27 clinical isolates carrying $bla_{SHV-12}$, and 5 reference strains carrying $bla_{SHV-1}$ to $bla_{SHV-5}$. All 39 strains carrying $bla_{SHV-2a}$ or $bla_{SHV-12}$ were positive by the PCR, providing confirmative evidence that IS26 has been involved in the evolution and dissemination of $bla_{SHV-2a}$ and $bla_{SHV-12}$. But 5 reference strains carrying $bla_{SHV-1}$ to $bla_{SHV-5}$ were negative by the PCR. Therefore, we concluded that the molecular evolutionary pathway of $bla_{SHV-2a}$ and $bla_{SHV-12}$ may be different from that of other $bla_{SHV-ESBL}$, e.g., $bla_{SHV-2}$, $bla_{SHV-3}$, $bla_{SHV-4}$, and $bla_{SHV-5}$.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제13권5호
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• pp.2045-2049
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• 2012

Objective: To investigate the effect of down-regulation of Sentrin/SUMO-specific protease 1 (SENP1) expression on the apoptosis of human Burkitt lymphoma cells (Daudi cells) and potential mechanisms. Methods: Short hairpin RNA (shRNA) targeting SENP1 was designed and synthesized and then cloned into a lentiviral vector. A lentiviral packaging plasmid was used to transfect Daudi cells (sh-SENP1-Daudi group). Daudi cells without transfection (Daudi group) and Daudi cells transfected with blank plasmid (sh-NC-Daudi group) served as control groups. Flow cytometry was performed to screen GFP positive cells and semiquantitative PCR and Western blot assays were employed to detect the inference efficiency. The morphology of cells was observed under a microscope before and after transfection. Fluorescence quantitative PCR and Western blot assays were conducted to measure the mRNA and protein expression of apoptosis related molecules (caspase-3, 8 and 9). After treatment with $COCl_2$ for 24 h, the mRNA and protein expression of hypoxia inducible factor -$1{\alpha}$ (HIF-$1{\alpha}$) was determined. Results: Sequencing showed the expression vectors of shRNA targeting SENP1 to be successfully constructed. Following screening of GFP positive cells by FCM, semiqualitative PCR showed the interference efficiency was $79.2{\pm}0.026%$. At 48 h after transfection, the Daudi cells became shrunken, had irregular edges and presented apoptotic bodies. Western blot assay revealed increase in expression of caspase-3, 8 and 9 with prolongation of transfection (P<0.05). Following hypoxia treatment, mRNA expression of HIF-$1{\alpha}$ remained unchanged in three groups (P>0.05) but the protein expression of HIF-$1{\alpha}$ markedly increased (P<0.05). However, in the sh-SENP1-Daudi group, the protein expression of HIF-$1{\alpha}$ remained unchanged Conclusion: SENP1-shRNA can efficiently inhibit SENP1 expression in Daudi cells. SENP1 inhibition may promote cell apoptosis. These findings suggest that SENP1 may serve as an important target in the gene therapy of Burkitts lymphoma.

• 미생물학회지
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• 제35권3호
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• pp.205-210
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• 1999

Vibrio cholerae 는 사람에게 설사를 일으키는 병원성 세규닝며 본 연구에 이용된 V.cholerae KNIH002 는 국내의 설사질환 환자로부터 분리하였다. 콜레라 독소 검출용 프라이머를 이용하여 PCR 로 증폭한 산물을 탐침자로 이용하여 Southern hybridization을 실시한 결과 PstI 및 BglII로 이중절단된 4.5-kb 절편내에서 ctx 유전자가 존재함을 확인하였다. 따라서 염색체 DNA를 PstI 및 BglII로 절단 후 V. cholerae KNIH002 의 유전자 mini-libraries를 제조하였다. 그리고 동일 탐침자를 이용하여 colony hybridization을 실시한 결과 제조된 유전자 mini-libraries 로부터 신호를 나타내는 한 개의 클론을 선발하였다. 선발된 클로닝 지니는 플라스미드를 pCTX75 라 명명하였으며, 이 클론은 CHO 세포에 대한 세포 독력이 나타남을 확인하였다. 염기서열을 결정한 결과 클로닝된 플라스미드에는 ace 와 zot 유전자들은 각각 ATG 개시코돈과 TGA 종결코돈을 포함하여 291 bp와 1,200 bp 로 구성되어져 있었다. ace 유전자의 염기서열은 V.cholerae E7946 EI Tor Ogawa strain 이 것과 100% 일치하였다. 그러나 zot 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 V. cholerae 395 Classical Ogawa strain 의 것과 각각 99% 및 98.8% 의 상동성을 보였다. 특히, V.cholerae 395 Classicale Ogawa strain 의 Zot 폴리펩타이드에서 100번, 272번, 281번째 alanine 은 V.cholerae KNIH002에서 모두 valine 으로 치환되어져 있었다.

• 미생물학회지
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• 제44권2호
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• pp.93-97
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• 2008

최근 Escherichia coli에서 RNA의 분해와 가공과정에 중추적인 역할을 하는 리보핵산 내부분해효소인 RNase E의 효소활성을 조절하는 단백질 조절자인 RraA가 밝혀졌으며, 이 단백질은 E. coli RNase E의 효소활성 부위와 36%의 유사성을 가지는, Streptomyces coelicolor RNase ES의 효소활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. S. coelicolor의 유전체에는 RraA와 아미노산 서열이 35.4% 이상 유사한 단백질을 코딩하는 유전자가 두 개 존재하는데, 그 중 하나인 rraAS2를 클로닝하여 E. coli RNase E의 효소활성을 조절하는지를 알아보았다. 그 결과 세포내에서 RraAS2를 발현시키면 RNase E의 과발현에 의해 저해된 세포의 생장을 RraA와 같이 효과적으로는 아니지만, 어느 정도 복원시키는 것을 확인하였다. 또한 RraAS2가 발현됨으로서 RNase E의 과발현에 의해 증가된 ColE1-타입 플라스미드의 복제 수를 14% 감소시키는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 RraAS2가 RNase E의 RNA I분자에 대한 효소 활성을 저해하는 능력을 가지고 있음을 시사한다. 동일한 배양조건에서 E. coli 세포내에서의 RNase E에 대한 RraAS2의 상대적인 발현양이 RraA에 비해 6.2배 낮은 것을 확인하였고, 이로 인해 RraAS2가 RNase E의 과발현에 의한 세포 생장의 저해를 복원하는데 필요한 모든 RNA의 가공과 분해속도를 효과적으로 조절하지는 못한다는 것을 추론할 수 있다.