• 농약과학회지
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• 제8권1호
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• pp.22-29
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• 2004

제초제저항성단백질인 phosphinotricin acetyltransferase(PAT)에 대한 유전독성 영향을 평가하기 위하여 in vitro 시험으로 복귀돌연변이시험과 염색체이상시험을, 그리고 in vivo 시험으로 소핵시험을 수행하였다. Salmonella typhimurium 균주 TA98, TA100, TA1535 및 TA1537를 이용한 복귀돌연변이시험에서 직접법과 대사활성법 (S9 mixture) 모두 $5000{\mu}g/plate$에서 돌연변이 수는 음성대조군과 유의차가 없었다. Chinese hamster lung(CHL) 세포를 이용한 염색체이상시험 결과 직접법과 대사활성법의 경우 PAT를 처리한 모든 군(100, 10, $1{\mu}g/mL$) 의 세포에서 구조적, 숫적 염색체이상은 관찰되지 않았다. PAT를 복강 투여한 ICR계 숫컷 mouse의 골수세포에서 다염성 적혈구 (polychromatic erythrocytes) 및 소핵 (micronucleus)을 가진 다염성 적혈구의 출현율을 조사하기위하여 mouse를 이용한 소핵시험을 수행한 결과, 모든 농도(1250, 625, 313 mg/kg)에서 음성대조군과 유의차가 관찰되지 않아, PAT는 소핵을 유발하는 독성은 없는 것으로 판단된다. 이상의 결과로 제초제저항성단백질 PAT는 미생물, 배양세포, 및 생체내에서 유전독성을 유발하지 않는 물질로 사료된다.

• 원예과학기술지
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• 제19권1호
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• pp.17-21
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• 2001

배추(Brassica campestris L. ssp. pekinensis) 형질전환 세포로부터의 식물체 재분화를 위한 선발체계를 확립하기 위하여 kanamycin, hygromycin, carbenicillin, cefotaxime등 4가지 항생제와 제초제 phosphinotricin가 자엽 및 배축 절편체로부터의 신초형성에 미치는 영향을 조사하였다. 자엽절편체는 kanamycin $1mg{\cdot}L^{-1}$처리에서 신초형성에 아무 영향을 받지 않았으나 $2mg{\cdot}L^{-1}$ 처리부터 형성수가 감소하여 $6mg{\cdot}L^{-1}$ 이상 처리구부터는 신초가 전혀 형성되지 않았다. 배축 절편체도 자엽과 비슷한 결과를 나타내어 kanamycin의 경우 $7mg{\cdot}L^{-1}$의 농도가 배추 형질전환체의 선발에 적당하다고 생각되었다. Hygromycin은 $4mg{\cdot}L^{-1}$ 처리부터 신초형성을 억제하여 배추형질전환을 위하여 낮은 농도로 사용할 수 있는 선발 마커로 생각된다. Cephalosporin type의 항생제인 carbenicillin과 cefotaxime은 신초형성에 아무 영향을 주지 않아 배추 절편체에 독성을 주지 않는 결과를 보여 주어, Agrobacterium과의 공동배양 후 이를 제거하는데 적당한 항생제라 할 수 있었다. 제초제인 phosphinotricin의 경우 $1mg{\cdot}L^{-1}$ 처리부터 신초 형성이 감소하기 시작하여 $2mg{\cdot}L^{-1}$ 이상부터는 완전히 억제되어 항생제와 더불어 형질전환 세포의 선발에 이용될 수 있다고 생각된다. 배추는 다른 배추속의 작물과 비교할 때 신초 재분화가 어렵기 때문에 비록 escape율이 높아진다고 해도 낮은 농도의 항생제나 제초제를 사용하여 선발압을 낮추어 주는 것이 형질전환에 효과적이라 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제14권2호
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• pp.368-373
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• 2004

광범위 제초제인 Bast $a^{(R)}$에 대해 저항성을 가지는 형질전환체 벼를 개발하였다. Bar유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pCaMV35S::Bar를 embryogenic 현탁 배양체로부터 분리한 벼의 원형질체에 도입하였다. Phosphinotricin에 대해 저항성을 가지는 형질전환체 식물체들이 재분화되었고, 이들을 15 mg/l phosphinotricin이 함유한 배지에서 다시 선별하였다. 형질전환체 벼에서 bar유전자의 삽입과 발현을 Southern과 Northern blot분석으로 확인하였고, 또한 $R_1$ 형질전환 식물체들을 PAT 활성 assay로 재차 유전자 발현을 확인하였다. Bar 유전자는 다음 세대인 $R_1$ 식물체에서 3:1 멘델 유전 양상을 나타내었고, 형질전환체 $R_1$과 $R_2$ 식물체들은 fieild에서 살포되는 제초제 양만큼 Bast $a^{(R)}$ 를 살포했을 때 제초제 저항성을 나타내었다..

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제2권3호
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• pp.143-149
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• 2000

An Efficient in vitro regeneration system and an optimized Agrobacterium mediated transformation protocol are described, based on the use of young seedling cotyledons of Capsicum annuum L. Optimal regeneration efficiency can be obtained by cultivating cotyledon explants on media containing 4 mg/L benzyladenine and 0.1 mg/L indolacetic acid. The effect of antibiotics used to eliminate Agrobacteria, as well as the toxic level of some generally used selection agents (kanamycin, geneticin, hygromycin, phosphinotricin and methotrexate) in regenerating pepper tissues were determined. To enable the comparison of different selection markers in identical vector background, a set of binary vectors containing the marker genes for NPTII, HPT, DHFR and BAR respectively, as well as the CaMV 35S promoter/enhancer-GUS chimaeric gene was constructed and introduced into four different Agrobacterium host strains.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제3권3호
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• pp.123-129
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• 2001

Electroporation of microcalli and embryonic axes of a Brazilian Indica rice cultivar was performed. Some parameters influencing the recovery of transformed callus have been defined through transient npt II expression. Such parameters included the presence of light during incubation of microcalli used as target for electroporation, heat shock at 45$^{\circ}C$, macerozyme pre-digestion of target tissues and the number of pulses during electroporation. Transgenic calli were obtained from embryonic axes after electroporation with plasmid pDM302, which encodes the gene phosphinotricin acetyl transferase (bar) under the control of Act-1 promoter. Integration of the introduced gene into the genome was demonstrated by Southern blot hybridization.

• 한국자원식물학회:학술대회논문집
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• 한국자원식물학회 2018년도 추계학술대회
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• pp.52-52
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• 2018

Development of herbicide resistant transgenic legume plants through Agrobacterium-mediated transformation has been worked in many previous studied. Plant regeneration after infection is the important step to obtain successful transgenic plants. Many attempts try to find the optimum media condition for plant regeneration after infection. However, the transformation efficiency of legume plants is still low. In this study, regeneration of some Korean legume species including two soybean cultivars (Dawon and Pungsan) and pea have been done with organogenesis which is used various kind of explants such as cotyledonary-nodes in soybean and bud-containing tissue in pea. We developed the optimum media condition for plant regeneration regulators under Agrobacterium-mediated transformation using different kind and various concentration of plant growth. As the results, B5 medium containing 2 mg/L of 6-benzylaminopurine was selected in this study for the optimum plant regeneration media. The segments were inoculated with Agrobacterium suspension harbored an IG2 vector containing bar gene which confers resistance to phosphinotricin (PPT) in 3, 5 and 7 days. The transformation efficiency was achieved in Dawon 3.03 % and pea 1.46 % with co-cultivation period of 7 days which is showed a high number of GUS positive expression period.

• 한국자원식물학회:학술대회논문집
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• 한국자원식물학회 2018년도 춘계학술발표회
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• pp.36-36
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• 2018

Soybean is the important crop in Asian countries as protein source, oil production and animal feed. Improving soybean using genetic transformation is the principal tool in nowadays. Developing herbicide resistant transgenic soybean plants through Agrobacterium-mediated transformation has been worked in many previous studied. However, the transformation efficiency is still low. Many attempts try to find the optimum media condition for plant regeneration after infection. After transformation, the plant regeneration is very important condition to promote growth of transgenic plant. In this study, we optimized a regeneration condition for two Korean soybean cultivar, Dawonkong and Pungsannamulkong using cotyledon, cotyledonary nodes and hypocotyl as explant. The results showed that shoot regeneration of cotyledonary nodes on B5 medium containing 2 mg/L 6-benzylaminopurine showed the highest percentage of regeneration in Dawonkong (75.8%) while Pungsannamulkong presented high number of shoots 2.12 shoots per explant. For transformation condition, co-cultivation in 7 days showed a high number of GUS positive expression. Most of explants can survived under media including 5 mg/L of glufocinate which refers phosphinotricin for 2-week selection. Washing with 400 mg/L of cefotaxime in several times and selection in plant regeneration media with 400 mg/L of cefotaxime can prevent bacteria growth, effectively.

• Plant Resources
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• 제7권1호
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• pp.39-46
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• 2004

To demonstrate the importance of transformation efficiency in independent event, molecular and cytogenetic analysis were conducted with genomic DNA and chromosome of transgenic plants produced by Agrobacterium tumefeciens LBA4404 (pSBM-PPGN: gusA and bar). Selection ratios of putative transgenic calli were similar in independent experiments, however, transformation efficiencies were critically influenced by the type of regeneration media. MSRK5SS-Pr regeneration mediun, which contains 5 mgL$^{-1}$ kinetin, 2% (w/v) sucrose in combination with 3% (w/v) sorbitol, and 500 mgL$^{-1}$ proline, was efficient to produce transgenic plant of rice from putative transgenic callus in the presence of L-phosphinotricin (PPT). With MSRK5SS-Pr medium, transformation efficincies of Nagdongbyeo were significantly enhanced from 3.7% to 6.3% in independent callus lines arid from 7.3% to 19.7% in plants produced, respectively. Stable integration and expression of bar gene were confirmed by basta herbicide assay, PCR amplification and Southern blotting of bar gene, and fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis using pSBM-PPGN as a probe. In Southern blot analysis, diverse band patterns were observed in total 44 transgenic plants regenerated from 20 independent PPT resistant calli showing from one to five copies of T-DNA segments, however, the transformants obtained from one callus line showed the same copy numbers with the same fractionized band patterns.

• 한국작물학회지
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• 제49권1호
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• pp.61-68
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• 2004

A reproducible transformation system via optimized regeneration media for Korean rice cultivars was established using Agrobacterium tumefeciens LBA4404 (pSBM-PPGN; gusA and bar). Although japonica rice genotypes were easier to produce transgenic plants compared to Tongil type cultivars, transformation efficiencies were not always correlated with regeneration efficiencies of non-transgenic callus on the control medium. Regeneration efficiencies of Donganbyeo, Ilmibyeo, and Manchubyeo were over 50% in non-transgenic control, however, transformation efficiencies were significantly low when only sucrose was added to the media as a carbon source. However, the medium, MSRK5SS-Pr (or MSRK5SM-Pr), that contains $5\textrm{mgL}^{-1}$ kinetin, $0.5\textrm{mgL}^{-1}$ NAA, 2 % sucrose (or maltose), 3% sorbitol, and $500\textrm{mgL}^{-1}$ proline, was the most efficient not only for regeneration of non-transgenic callus but also for regeneration of transgenic callus in the presence of L-phosphinotricin (PPT). Average transformation efficiencies of 16 Korean rice cultivars were significantly enhanced by using the optimized medium from 1.5% to 5.8% in independent callus lines and from 2.9% to 19.4% in tromsgenic plants obained. Approximately 98.9% (876 out of 885) transgenic plants obtained on optimized media showed basta resistance. Stable integration, inheritance and expression of gusA and bar genes were continued by GUS assay and PCR and Southern analysis of the bar gene. With Pst1 digestion of genomic DNA of transgenic plants, one to five copies of T-DNA segment were observed; however, 76% (19 out of 25 transgenic plants) has low copy number of T-DNA. The transformants obtained from one callus line showed the same copy numbers with the same fractionized band patterns.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권4호
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• pp.293-300
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• 2011

실험은 심비디움 원괴체 (PLB: protocorm-like bodies)를 재료로 유전자총을 이용한 효율적인 형질전환 조건을 확립하고자 수행되었다. 이 PLB 조직에 제초제저항성 유전자인 bar 유전자와 reporter 유전자인 gus를 포함하고 있는 pCAMBIA3301 벡터를 이용하여 유전자총으로 형질전환 하였다. 형질전환 벡터에 포함되어 있는 제초제저항성유전자 (bar)를 이용하여 선발하게 되므로 선발배지에 첨가될 제초제로서 PPT (Phosphinotricin)의 적정 농도를 찾고자 실험한 결과, 5 mg/l에서 최적의 대부분의 PLB의 생육이 억제되고 신초형성이 이루어지지 않았다. 이를 기반으로 유전자총 실험에 맞는 최적 조건을 찾는 실험을 수행하여 1.0 ${\mu}m$ gold입자크기, 헬륨가스 압력은 1,100과 1,350 psi사이에서는 차이가 없다는 전제 하에 물리적 피해가 덜 가는 1,100 psi를 조건으로 선택하였고, 유전자총과 목표물과의 거리는 6 cm 그리고 DNA 농도는 1회 유전자총 발사횟수당 1.0 ${\mu}g$ 조건을 최적조건으로 하였다. 이 조건을 기반으로 100개의 PLB를 형질전환 하면 평균적으로 6 ~ 8개의 PLB가 제초제 저항성을 나타내는 개체로 성장하고 최종적으로 2개체 정도가 온실에서 순화과정을 거쳐 완전한 형질전환 식물체로 생산된다. 이외에도 유전자총 실험 전에 0.2 M sorbitol과 0.2 M mannitol을 혼합처리하여 4시간 동안 배양시키면 2배 이상 효율을 높일 수 있게 되어, 결론적으로 100개의 PLB를 형질전환 수행하면 최종적으로 3.2 ~ 4.0개 정도의 형질전환 심비디움 식물체가 나오는 효율이라고 할 수 있다. 본 실험을 통해 생산된 형질전환 심비디움 개체들은 PCR 분석을 통해 유전자 도입을 확인하였고, 형질전환 개체 중 임의로 선발된 5계통들의 잎을 Basta 0.5% 용액에 침지한 결과, 3 계통은 제초제에 저항성을 가지는 것으로 확인되었고, 그중 1계통은 아주 강한 저항성을 보여주었다. 본 실험 결과들을 바탕으로 환경저항성 등의 유용유전자가 도입된 형질전환 심비디움 식물체 개발에 기여하리라 사료된다.