• BMB Reports
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• 제30권6호
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• pp.379-384
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• 1997

The effects of several ions on the specific activity and isozyme patterns of cellular and secretory isoperoxidases were studied in suspension-cultured cells of rice (Oryza sativa L.). Peroxidase release into the culture medium occurred in the absence of added calcium. The addition of calcium ion greatly stimulated the secretion of cationic isoperoxidases such as C2 and C3 into the medium: a maximum 11 fold increase of secretions occurred in the presence of 5 mM $CaCl_2$, and the secretion was accomplished within 1 hour after the addition of $CaCl_2$. About a 10 fold increase of the peroxidase secretion into the medium did occur with 0. 5% NaCl, whereas cellular isoperoxidase levels were reduced notably. About a 6 fold increase of the specific activity of cellular isoperoxidase was found in 5 mM $NiCl_2$-treated cell, while $NiCl_2$ had no effect on the secretion of peroxidase into the medium. Various concentrations of KCl did not change peroxidase secretion, but 5 mM $ZnCl_2$ reduced peroxidase secretion greatly. The major secretory isoperoxidases stimulated by $CaCl_2$, NaCl and cellulase were composed of cationic isoperoxidases C2 and C3, which were found to be localized in the cell wall of rice by examination of the enzyme in the protoplast. Furthermore, the secretion rates of secretory isoperoxidases were increased rapidly when cellulase was treated in the absence of the osmotic stabilizer of 0.4 M mannitol. These results suggest that the stimulations of secretory isoperoxidase levels seem to be due to the stimulation of secretion into the culture medium of rice.

• 한국균학회지
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• 제12권1호
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• pp.9-14
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• 1984

느타리 버섯의 세포(細胞) 융합(融合)에 의(依)한 신품종(新品種)을 육성(育成)하기 위(爲)한 첫단계로 균사(菌絲)의 원형질나출(原形質裸出)을 위(爲)한 일련의 실험(實驗)을실시(實施)한 결과(結果) 다음과 같은 결론(結論)을 얻었다. 느타리 버섯 균사(菌絲)의 원형질체(原形質體)는 균사체(菌絲體)를 버섯 완전배지(完全培地)에 4일간(日間) 배양(培養)하였을 때 나출수(裸出數)가 가장 많았으며 삼투압 조절제(調節劑)는 $MgSO_4$와 KCl이 효과적(效果的)이었고 농도(濃度)는 $MgSO_4$를 사용(使用)하였을 0.8M 때에서 우수(優秀)하였다. 세포벽(細胞壁) 분해(分解) 효소(酵素)는 Novozym 234를 15mg/ml사용시(使用時) 가장 효과적(效果的)이었으며 효소액(酵素液)의 최적(最適) pH는 $5.5{\sim}6.0$이었다. 균사체(菌絲體)의 분해적온(分解適溫)은 $28^{\circ}C$였으며 75rpm으로 진탕할 때 가장 많은 원형질체(原形質體)를 얻을 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제31권3호
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• pp.218-223
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• 1993

Conditions for the release and regeneration of protoplasts form Rhizopus oryzae and intergeneric protoplast fusion between Rhizopus oryzae and Aspergillus oryzae were studied. High yields of protoplast fusion between Rhizopus oryzae and Aspergillus oxyzae were studied. High yield of protoplasts from young germilings of R. oryzae were obtained by using lytic enzymes containing chitosanase (3 mg/ml), chitinase (3 mg/ml) and Novozym 234 (5 mg/ml). 0.5M glucose was used as the osmotic stabilizer and optimum pH of buffer was determined to be pH 7.5-8.0. Under these conditions, protoplasts were formed after about 3-4 hrs incubation. Approximately, 1.0%-4.9% of these protoplasts were formed after about 3-4 hrs incubation. Approximately, 1.0%-4.9% of these protoplasts regenerated on solid medium with a soft agar overlay. We have also carried out protoplasts fusion between R. oryzae and A. oryzae and have succeeded in obtaining three types of intergeneric fusants. In these experiments, 35% PEG-4000 and 10 mM CaCl$_{2}$ were used as fsogenic agents, and auxotrophic properties were used as a genetic marker to select fusants. Complementation frequency be protoplasts fusion of A. oxyzae and R. oryzae was 4.4% * 10$^{-5}$ . The fusant strains of the first type were prototrophs showing an Aspergillus type morphology with dark-yellow sporulation, those of the second type were also Apergillus type morphology but showed no sporulation. And the strains of the third type stopped growing when fusion products grown on regeneration minimal medium were transferred to fresh minimal medium. The formation of fusion products was observed by fluorescent vital stains for complementary labelling of protoplats from R. oryzae and A. oryzae. Rhodamine 6G and fluorescein diacetate wer useful complementary vital stains of Rhizopus and Aspergillus protoplasts for visualization of requency and type (dicell, multicell) of fusion.

• 한국식품영양과학회지
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• 제24권6호
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• pp.964-969
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• 1995

섬유성 biomass의 효율적인 이용을 위하여 CMCase, avicelase 분비력이 높은 균주(A. wentii MAW-598)와 ${\beta}-glucosidase$ (A. niger MAN-831) 분비력이 우수한 균주의 포자를 이용한 원형질세 형성.재생조건 및 융합을 실시하였다. 원형질체 형성 및 재생의 최적조건은 5일 성숙한 포자를 $30\mu\textrm{g}/ml$ 농도의 2-DG로 4시간 전배양하여 0.7M KCI 삼투압 안정제, novozyme(7.5mg/ml)+driselase(2.5mg/ml) 혼합효소로 5시간 반응시키는 것이 효과적이었다. 원형질체 융합 조건은 $CaCl_2$ 15mM, 25% PEG 4000, pH 5-7, $36^{\circ}C$에서 25~30분간 처리하였을때 효과적이었으며, 융합빈도는 $7.94\;{\times}\;10^{-4}$로 나타났다. FA-208 융합주는 친주에 비하여 각각 1.5, 1.3, 1.2배 효소활성의 증가를 나타내었다.

• 한국균학회지
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• 제19권4호
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• pp.276-281
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• 1991

UV에 의해 유도된 P. tannophilus 영양요구주는 Iysine요구성, arginine요구성, methionine요구성, cysteine요구성 등이었다. Protoplast의 생성조건은 Zymolyase농도 0.5 mg/ml, pH 6.5-8.5, 온도는 $37{\sim}47^{\circ}C$, 삼투안정제는 KCI로 하여 1시간 배양이 최적이었다. 세포융합에 의해 생성된 융합주는 체적이 친주의 약 4배이고 형태적으로는 친주와 비슷한 구형 또는 난형이었으나 위균사의 형성이 자주 관찰되었다. 그리고 융합주는 xylose를 탄소원으로 하였을 때에는 발효능의 증대는 없었으나 생육도는 약 2배 증가한 반면에 arginine요구성 변이주인 M7은 생육도의 증가는 없었으나 1.6배의 발효능증대를 나타내었다.

• 미생물학회지
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• 제37권1호
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• pp.42-48
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• 2001

출아 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 베타-1,3-글루칸 생합성의 결함을 초래하는 돌연변이 유전자(sool-1)를 분리하여 돌연변이 부위의 염기서열을 결정하고 그 특성을 분석하였다. cool-1 유전자의 염기서열 분석 결과, 681번의 염기인 G가 A로 치환되어 Soolp의 $Gly^{227}$이 Asp로 치환되는 결과를 나타내는 것으로 판명되었고, cool-1 유전자는 기존에 보고된 retl-1 유전자와 동일한 돌연변이 유전자로 판명되었다. 그러나, ret1-1이 나타내는 온도감수성 형질은 배지에 1.2 M sorbitol 등의 삼투안정제를 첨가하면 극복될 수 있으며, cool-l/retl-1의 돌연변이 부위가 세포벽합성 관련 단백질의 번역 후 수식과정에 영향을 미친 것임을 확인하였다. 한편, Soolp/$\alpha$-COP의 N-말단에 존재하는 6개의 WD40 domain중 5번째 WD40 domain이 효모의 세포벽 합성이나 구조유지에 중요한 역할을 담당할 것임을 시사하는 결과를 얻었다.

• 한국균학회지
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• 제15권2호
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• pp.80-86
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• 1987

자연계에서 섬유소분해능이 우수한 균을 분리하였고 섬유소분해능을 더욱 증진시키기 위한 기초단계로서 그 분리균주의 원형질체 생성과 융합의 최적조건을 조사하였다. 토양에서 채취한 시료로부터 섬유소분해능력이 우수한 Aspergillus sp., Penicillium sp., Trichoderma sp., 3균주를 분리 동정하였고 산업적으로 유용한 균주이며 cellulase activity가 있는 Aspergillus niger를 비교균주로 선택하여 각각의 효소활성도를 비교 조사한 결과, Aspergillus sp.가 가장 좋은 효소활성도를 보였으며 그 다음 Penicillium sp., Trichoderma sp., 그리고 Aspergillus niger 순이었다. 효소활성도가 가장 좋은 Aspergillus sp.에 자외선$(12erg/sec/mm^2)$을 4 분 30초 동안 조사하여 영양요구성 변이주를 유도, 분리하였다. 세포벽분해효소로는 pH6.0에서 ${\beta}-glucuronidase$가 효과적이었고 그 효소를 농도별로 처리해본 결과 5, 000unit/ml가 최적농도이었다. 재생률은 삼투안정제로 0.6M KCI을 사응하여 pH6.0에서보았을 때 야생형은 7.0%, met. 영양요구주는 7.5%, arg. 영양요구주는 5.2%이있다. 영양요구성변이주간의 원형질체융합에 필요한 PEG는 분자량이 6,000인 것이 좋았으며 최적농도는 $30^{\circ}C$ 이었다. 이때 융합율은 1.2%까지 획득하었다.

• 한국균학회지
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• 제16권2호
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• pp.70-78
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• 1988

평이버섯의 유전연구(遺傳硏究)와 신품종(新品種) 육성(育成)의 기초자료(基礎資料)를 얻기 위하여 팽이버섯의 원형질체(原形質體) 나출(裸出)에 영향(影響)을 미치는 제(諸) 요인(要因)을 구명(究明)한 결과(結果)는 다음과 같다. 팽이버섯의 균사생장(菌絲生長) 및 원형질체(原形質體) 나출(裸出)에 알맞은 배지(培地)는 Potato Dextrose peptone Agar였으며 5일간(日間) 배양(培養)된 지수적(指數的) 생장기(生長期)의 균사체(菌絲體)에서 원형질체(原形質體) 나출량(裸出量)이 가장 많았다. MMM 배지(培地)에서는 전혀 나출(裸出) 되지 않았다. 원형질체(原形質體)의 나출(裸出)은 Novozyme 234+Cellulase CP를 10 mg$ml^{-1}$ 농도(濃度)로 사용(使用)하였을때 $52.0{\times}10^{5}ml^{-1}$로 가장 높았으며 최적(最適) 반응시간(反應時間)은 3시간(時間)이었다. Novozyme 단독처리구(單獨處理區)에서는 나출량(裸出量)이 반정도 였다. 효소액(酵素液) pH의 영향(影響)은 삼투압조절제(參透壓調節劑)의 종류(種類)에 따라 차이(差異)를 보였다. 예소액(醴素液)의 반응시간(反應時間)은 Novozyme 234+cellulase CP 10 mg $ml^{-1}$의 경우 3시간(時間) 후(後) 최대(最大) 조출량(操出量)을 보였다. 삼투압조절제는 0.6 M의 Sucrose가 효과적(效果的)이었으며 완형액(緩衡液)없이 pH 6.2로 사용(使用)할 때 원형질체(原形質體)의 나출량(裸出量)이 가장 많았다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권1호
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• pp.69-76
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• 2011

This study describes the effect of myo-inositol on sustained cell division and plant regeneration from cotyledon-derived protoplast of cabbage (Brassica oleracea var. capitata). Freshly isolated protoplasts were cultured in modified Murashige and Skoog (MS) medium removed ammonia ions and containing $0.4\;mg\;l^{-1}$ thiamine HCl, $100\;mg\;l^{-1}$ myo-inositol, $2\;mgl^{-1}$ 2,4-D, $0.5\;mgl^{-1}$ BA, $30\;gl^{-1}$ sucrose and several concentrations of myo-inositol (2, 4, 6, 8, 10% (w/v)) as an osmotic stabilizer. After 3 weeks of culture in the dark at $25^{\circ}C$, the plating efficiency of cabbage protoplasts reached to $22.5{\pm}2.9%$ when cultured in modified MS medium supplemented with $2\;mgl^{-1}$ 2,4-D, $0.5\;mgl^{-1}$ BA, $30\;gl^{-1}$ sucrose and 8% (w/v) of myo-inositol at a density of $2{\times}10^5$ protoplasts/ml. Rapidly growing cell colonies after 3 weeks of culture were transferred to the same culture medium removed osmoticum. To induce shoot regeneration from calluses, calluses with about 2 mm in diameter were transferred to the MS medium containing $2\;mgl^{-1}$ BA and $0.5\;mgl^{-1}$ NAA. After further three weeks of incubation onto the medium in the light, green shoots were formed on the surface of calluses at a frequency of 30%. Upon transfer to half-strength MS basal medium, roots were formed onto the bottom of regenerated shoots without auxin treatments. These regenerated plantlets were successfully acclimatized to soil transfer, grown to normal mature plants. The cabbage protoplast culture system established in this study could be applied for production of somatic hybrids or cybrids by asymmetric protoplast fusion and mass proliferation of elite somatic clones of cabbage.

• 한국균학회지
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• 제17권1호
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• pp.1-6
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• 1989

벼 도열병균(稻熱病菌)(Pyricularia oryzae)을 감자 액체배지(液體培地)에서 $27^{\circ}C$, 48시간(時間) 배양(培養)한 후(後), 균사체(菌絲體)에 Driselase, ${\beta}-Glucuronidase$, Cellulase, Macerozyme R-10의 혼합(混合) 효소(酵素) 액(液)을 처리(處理)한 30분후(後)부터 원형질체(原形質體)가 형성(形成)되었다. Race KJ101이 KI315a보다 더 많은 원형질체(原形質體)가 형성(形成)되었다. 2-Mercaptoethanol을 혼합(混合) 효소액(酵素液) 처리전(處理前), 균사체(菌絲體)에 전처리(前處理) 함으로써 3시간(時間) 후부터 줄어들던 대조구(對照區)보다 원형질체(原形質體) 형성량(形成量)을 증가(增加)시킬 수 있있다. 특히 2-Mercaptoethanol 10mM처리(處理)에서는 효소액(酵素液) 처리(處理) 5시간(時間) 후(後)에 최대(最大)의 원형질체(原形質體) 형성량(形成量)을 보였으나 200-mM 처리구(處理區)에서는 오히려 원형질체(原形質體) 형성(形成)을 억제(抑制)하였다. 균사체(菌絲體)로부터 형성(形成)된 원형질체(原形質體)를 $27^{\circ}C$의 액체배지(液體培地)(2.5% yeast extract, 2% dextrose)에서 진탕 배양(培養)하면 5시간(時間) 후(後)부터 크게 세가지 형태(形態)로 재생(再生), 복귀(復歸)되었다. Yeast와 같은 연쇄(連鎖) 사슬형태(形態)로 되거나, 연쇄(連鎖)사슬의 선단부에서 발아관(發芽管)과 유사(類似)한 균사체(菌絲體)가 형성(形成)되거나, 혹은 처음부터 발아관(發芽管)과 같은 균사(菌絲)가 형성(形成)되었다. 삼투압 안정제(安定劑)를 첨가(添加)한 고체(固體) 배지(培地)에 도열병균(稻熱病菌)의 원형질체(原形質體)를 접종(接種)하여 $27^{\circ}C$에서 5일간 배양(培養)하면 정상적(正常的)인 균사체(菌絲體)로 복귀(復歸)되어 균총(菌叢)을 형성(形成)하였다. 이때 사용(使用)한 Mannitol, Sorbitol, KCI, $MgSO_4$ 등의 삼투압 안정제중(安定劑中)에서 0.6M KCI을 감자한천배지(寒天培地)에 첨가(添加)했을 때 33.4%의 가장 높은 복귀율(復歸率)을 보였으나, 물 한천배지(寒天培地)에서는 삼투압 안정제(安定劑)의 종류(種類)와는 관계(關係)없이 원형질체(原形質體)가 정상적(正常的)인 균사체(菌絲體)로 복귀(復歸)하지 못하였다.