• 미생물학회지
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• 제30권6호
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• pp.539-545
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• 1992

Lactobacillus casei SM-M1 의 플라스미드로부터 phospho-$\beta$-galactosidase gene 을 갖는 DNA 를 E. coli 에 클로닝한 pPLac15(13kb) 의 재조합 플라스미드를 제조하였다.(15). pPLac15 DNA 를 분리하여 제한효소로 처리하여 제한효소 지도를 작성하였다. Phospho-$\beta$-galactosidase 유전자의 발현을 높이기 위하여 lac promoter 를 가진 pUC18 의 PstI 위치에 클닝하여 pPLac18 을 제조하였으며, 이것을 다시 EcoRI 으로 절단하여 pUC 18 에 클로닝하여 얻은 pPLac23 (7.6 kb) 를 얻었다. Phospho-$\beta$-galactosidase 효소활성은 pPLac23 의 형질전환주인 E. coli SW-23 에서는 pPLac15 를 가진 형질전환주인 E. coli SW-15 보다 약 1.8 배의 효소의 활성을 나타내었으며 pPLac18 을 가진 E. coli SW-18 보다는 약간 높은 활성을 나타내었다.

• 한국식물병리학회:학술대회논문집
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• 한국식물병리학회 1995년도 Proceedings of special lectures on Molecular Biological Approaches to Plant Disease National Agricultural Science and Technology Institute Suwon, Korea
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• pp.97-117
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• 1995

Copper resistance in Pseudomonas syringae pv. tomato is determined by copper-resistance operon (cop) on a highly conserved 35 kilobase plasmid. Copper-resistant strains of Pseudomonas syringae containing the cop operon accumulate copper and develop blue clonies on copper-containing media. The protein products of the copper-resistance operon were characterized to provide an understanding of the copper-resistance mechanism and its relationship to copper accumulation. The Cop proteins CopA (72 kDa), CopB (39 kDa), and CopC (12 kDa) were produced only under copper induction. CopA and CopC were periplasmic proteins and CopB was an outer membrane protein. Leader peptide sequences of CopA, CopB, and CopC were confirmed by amino-terminal peptide sequencing. CopA, CopB, and CopC were purified from strain PT23.2, and their copper contents were determined. One molecule of CopA bound 10.9${\pm}$1.2 atoms of copper and one molecule of CopC bound 0.6${\pm}$0.1 atom of copper. P. syringae cells containing copCD or copBCD cloned behind the lac promoter were hypersensitive to copper. The CopD (32 kDa), a probable inner membrane protein, function in copper uptake with CopC. The Cop proteins apparently mediate sequestration of copper outside of the cytoplasm as a copper-resistance mechanism.

• Archives of Pharmacal Research
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• 제16권4호
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• pp.271-275
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• 1993

In order to prepare a novel human insulin analogue suhbstituted with homoserine at B$^{30}$ / position, (B$^{30}$ /-homoserine) human insulin, a synthetic gene was designed by linking directly a gene for B chain with that for A chain. This gene was constructed by enzymatic joining of 10 different synthetic oligonucleotides, and then inserted at the polylinker region of pUC19 plasmid. To achieve a high level of gene expression, the gene fusion technique region of pUC19 plasmid. To achieve a high level of gene expression, the gene fusion technique was employed using amino terminal regions of lacZ gene up to Clal or hpal, and either of them has been located under tac promoter. The chemical induction of these fused genes by isopropyl-.betha.-D-thiogalactopyranoside (IPTG) gave a satisfactory level of expression in Escherichia coli harboring the ocnstructed plasmids. It was observed that the fused gene product as a single chain insulin precusor was produced more than 30% of total cell protein of E. coli as a form of inclusion body.

• 상하수도학회지
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• 제20권6호
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• pp.893-904
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• 2006

To improve sensitivity of biosensor as yeast two-hybrid detection system for estrogenic activity of suspected chemicals, we tested effects of several combinations of the bait and fish components in the two-hybrid system on Saccharomyces cerevisiae inducted a chromosome-integrated lacZ reporter gene that was under the control of CYC1 promoter and the upstream Gal4p-binding element $UAS_{GAL}$. The bait components that were fused with the Gal4p DNA binding domain are full-length human estrogen receptor ${\alpha}$ and its ligand-binding domain. The fish components that were fused with the Gal4p transcriptional activation domain were nuclear receptor-binding domains of co-activators SRC1 and TIF2. We found that the combination of the full-length human estrogen receptor ${\alpha}$ with the nuclear receptor-binding domain of co-activator SRC1 was most effective for the estrogen-dependent induction of reporter activity among the two-hybrid systems so far reported. The relative strength of transcriptional activation by representative natural and xenobiotic chemicals was well correlated with their estrogenic potency that had been reported with other assay systems.

• 대한바이러스학회지
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• 제27권2호
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• pp.239-255
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• 1997

전염성 췌장괴저바이러스 (Infectious pancreatic necrosis virus) DRT 주의 VP1유전자를 대 장균 발현운반체와 Baculovirus에 삽입하여 대장균과 진핵세로에서 VP1단백질의 발현을 연구하였다. 재조합체 pMal-pol 클론 [7]에서 2.7 Kb 단편인 VP1 유전자를 제한효소 XbaI으로 절단하여 Baculovirus 운반체인 pBacPAK9에 클로닝하여 pBacVP1이라 명명하였다. 이 pBacVP1에 클로닝된 VP1유전자를 제한효소 SacI과 PstI으로 절단하여 대장균 발현 운반체인 pQE-30에 클로닝하여 pQEVP1이라 명명하였다. 또한 VP1 단백질의 C-말단에 6개의 히스티딘 $6{\times}His$이 붙어 있는 단백질을 만들기 위하여, pQEVP1 클론의 His부위를 EcoRI으로 절단하고, 또한 pBacVP1을 EcoRI으로 절단하여 생긴 부위에His-EcoRI DNA 단편을 교체시켜 재클로닝하여 pBacHis-VP1을 만들었다. pBacHis-VP1 DNA와 Bsu36I로 처리된 LacZ-Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus (LacZ-HcNPV)를 함께 lipofectin을 이용하여 곤충세포 (Spodoptera frugiperda cell)에 동시 감염을 시켜서 재조합 바이러스를 선발하여, VP1-HcNPV-1이라 명명하였다. pQEVP1 클론은 6개의 히스티딘 단편이 부착된 VP1단백질을 Ni-NTA resin 크로마토그래피법으로 정제하여 SDS-PAGE와 Western blot으로 확인하였고, 단백질의 활성과 구조에 영향을 주지 않는 6개의 히스티딘 단편 ($6\;{\times}\;His$)이 부착된 94 kDa의 VP1단백질을 정제할 수 있었다. 또한 재조합 바이러스에 감염된 곤충세포에서 VP1 단백질이 발현된 것을 전기영동과 Western blot으로 검색을 한 결과 95 kDa VP1 단백질이 발현이 되었음을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권4호
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• pp.334-342
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• 1989

Bacillus stearothermophilus의 cytidine deaminase (cytidine/2'-deoxycytidine aminohydrolase：EC 3.5.4.5)를 코딩하는 cdd 유전자를 E. coli cdd$^-$ 결손변이주를 cloning host로 하여 3-10Kbp의 B. stearothermophilus DNA 단편으로부터 shot gun 법으로 클로닝하였다. 고 복제수 플라스미드 pBR322 의 PstI 부위에 3.0Kb의 B. stearothermophilus DNA 단편을 함유한 pJSC101이 cdd$^+$와 tetracy-line 내성으로서 cloning되었으며, 이어서, 결실 및 subcloning을 연속 수행한 결과 약 1.35kbp의 Eco RI$_1$/PstI$_2$단편이 동일 부위의 pBR322에 삽입된 cdd 양성의 pJSC201을 얻었다. Mini 세포 실험결과, 이 단편에서 합성되는 polypeptide는 약 33 KDa이었기에 이 polypeptide가 cytidine deaminase 로 추정되었다. 또한 이 단편에 함유한 550bp의 EcoRI/AvaI 부분을 lacZ 프로모터 영역에 삽입한 경우 프로모터 활성을 나타내었기에 이 단편의 Eco RI 부위에서 PstI부위로 cdd 유전자가 전사됨을 알 수 있었다. B. subilis와 E. coli에서 발현이 가능한 shuttle vector에 cdd가 함유된 단편을 삽입한 후 이를 양세포에서 동시 발현시켰을 때 B. subtilis에서 발현시킨 경우가 E. coli에서 보다높은 cytidine deaminase 활성을 나타내었으며 이 유전자는 B. subtilis 에서도 E. coli에서와 같이 안정하게 유지됨을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제26권5호
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• pp.503-508
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• 2016

바이오센서는 간단하고 저렴하게 일차적으로 현장 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서는 유전자 재조합으로 카드뮴을 검출할 수 있는 미생물 유래 바이오센서를 제작하였다. 이를 위해 카드뮴과 반응하는 CadC 유전자와 관련 프로모터를 PCR로 증폭하고 β-galactosidase 유전자(lacZ)와 결합하고 E. coli BL21 (DE3)에 형질 전환하였다. 이 바이오센서 세포는 카드뮴 존재 하에서 β-galactosidase를 발현하며 기질인 CPRG을 분해하여 붉은색으로 발색된다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 카드뮴으로 3시간 유도하였을 때 β-galactosidase 활성의 최고값을 보여주었으며 pH 5에서 가장 좋은 활성도를 나타내었다. 카드뮴 검출용 바이오센서는 0.01 μM에서 10 mM 카드뮴에서 검출범위를 보여주었으며 0.01~10 μM에서 직선관계의 검정선(y= 0.98 X + 0.142, R²=0.98)를 나타내었다. 중금속 중에서 카드뮴과 납에서 높은 반응성을 보여주었으며 수은과 구리에서는 전혀 반응하지 않았으나 주석과 코발트에서도 약간의 반응성을 나타내었다. 카드뮴을 spike 한 폐수에서의 반응이 완충용액에 spike한 것(control)과 비슷하게 나타났다. 이는 카드뮴 검출용 바이오센서가 전처리를 하지 않은 현장시료에서도 반응성을 보여주어 현장시료의 간단하고 저렴한 일차적 검출에 활용될 수 있음을 시사한다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권1호
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• pp.15-22
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• 1998

일반적으로 Streptomyces류는 성장이 늦고 유지가 어려운 반면, E. coli는 배양기간이 짧고 유전자 조작도 간편한 장점이 있기 때문에, E. coli를 이용하여 유용단백질을 생산하는 연구가 일반적인 흐름이다. 그러나 E. coli에서 외래유전자를 도입하여 대량으로 생산을 시키는 경우에 비용해성의 inclusion body를 형성하는 경우가 많으므로 용해성의 활성형 단백질을 생산하기 위하여는 여러 가지 조건을 고려하여야 한다. 본 논문에서는 aklavlnone 11-hydroxylase gene(dnrF)을 E. coli BL2l에서 발현시킬 때의 배양조건을 배양온도와 IPTG농도의 두가지 요소를 조합하여 변형시키는 방법으로, 활성형 단백질의 생산을 최대화하고 inclusion body의 형성을 최소화하는 배양조건을 조사하였다. 그 결과, 37$^{\circ}C$에서 배양했을 때에는 0.02mM의 IPTG를 첨가하였을 때 inclusion body를 가장 적게 만들고, 그에 따라 생산되는 효소활성도 가장 높았다. 반면, 28$^{\circ}C$로 배양온도를 낮추었을 때에는 0.06mM의 IPTG를 첨가하였을 때 aklavinone 11-hydroxylase효소가 최대로 생산됨을 SDS-PAGE 및 효소 활성측정으로 확인하였다. IPTG농도를 0.1 mM로 높인 경우에는 28$^{\circ}C$, 37$^{\circ}C$에서 모두 aklavinone 11-hydroxylase효소가 과발현되어 Inclusion body를 가장 많이 생성하였음을 알 수 있었다. 방선균에서 동일 유전자를 대량발현시키는 경우 발현된 단백질의 효소 활성은 있으나 SDS-PAGE상에서의 단백질의 관찰이 불가능하였고, 동시에 단백질의 정제시 효소활성이 소실되어 정제가 불가능하였다. 이러한 효소 활성의 소실의 원인은 세포내의 어떤 저분자물질일 것으로 추정되며 본 연구에서 제작한 antibody를 이용하면, 효소의 정제가 용이하게 수행될 것이다. 특히 대장균계에서의 활성형 효소의 최적발현조건에서 세포를 배양하거나, inclusion body의 refolding을 실시한 후, 항체를 이용한 Western blot assay를 지표로 효소를 정제하면, 미지의 cofactor의 정체도 밝혀지고 aklavinone 11-hydroxylase류의 효소 특성 연구에 큰 도움이 될 것이다. 또한 이 효소를 이용한 다양한 종류의 bioconversion을 실시하여 그동안 background 때문에 생성된 product의 검출이 불가능했었던 소량의 생성산물의 분석도 가능할 것으로 판단되어 금후의 bioconversion연구에 기대하는 바가 크다.

• 한국환경성돌연변이발암원학회지
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• 제22권3호
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• pp.175-182
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• 2002

Endocrine disruptors (EDs) are the chemicals that affect endocrine systems through activation or inhibition of steroid hormone response. It is necessary to have a good system to evaluate rapidly and accurately endocrine-disrupting activities of suspected chemicals and their degradation products. The key targets of EDs are nuclear hormone receptors, which bind to steroid hormones and regulate their gene transcription. We constructed a co-expression system of Gal4p DNA binding domain (DBD)- ligand binding domain of human estrogen receptor $\alpha$ or $\beta$, and Gal4p transactivation domain (TAD)-co-activator AIB-1, SRC-1 or TIF-2 in Saccharomyces cerevisiae with a chromosome-integrated lacZ reporter gene under the control of CYC1 promoter and Gal4p binding site (GAL4 upstream activating sequence, GAL4$_{UAS}$). Expression of this reporter gene was dependent on the presence of estrogen or EDs in the culture medium. We found that the two-hybrid system with combination of the hER$\beta$ LBD and co-activator SRC-1 was most effective in the xenoestrogen-dependent induction of reporter activity. The extent of transcriptional activation by those chemicals correlated with their estrogenic activities measured by other assay systems, indicating that this assay system is efficient and reliable for measuring estrogenic activity. The data in this research demonstrated that the yeast detection system using steroid hormone receptor and co-activator is a useful tool for identifying chemicals that interact with steroid receptors.s.

• 한국생명과학회:학술대회논문집
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• 한국생명과학회 2001년도 제34회 학술심포지움
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• pp.3-8
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• 2001

Isopentenyl diphosphate (IPP) is the common, five-carbon building block in the biosynthesis of all carotenoids, IPP in Escherichia coli is synthesized through the non-mevalonate pathway. The first reaction of IPP biosynthesis in E. coli is the formation of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DXP), catalyzed by DXP synthase and encoded by dxs. The second reaction in the pathway is the reduction of DXP to 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, catalyzed by DXP reductoisomerase and encoded by dxr. To determine if one or more of the reactions in the non-mevalonate pathway controlled flux to IPP, dxs and dxr were placed on several expression vectors under the control of three different promoters and transformed into three E. coli strains (DH5(, XL1-Blue, and JM101) that had been engineered to produce lycopene. Lycopene production was improved significantly in strains transformed with the dxs expression vectors. When the dxs gene was expressed from the arabinose-inducible araBAD promoter (PBAD) on a medium-copy plasmid, lycopene production was 2-fold higher than when dxs was expressed from the IPTG-inducible trc and lac promoters (Ptrc and Plac, respectively) on medium-copy and high-copy plasmids, Given the low final densities of cells expressing dxs from IPTG-inducible promoters, the low lycopene production was probably due to the metabolic burden of plasmid maintenance and an excessive drain of central metabolic intermediates. At arabinose concentrations between 0 and 1.33 mM, cells expressing both dxs and dxr from PBAD on a medium-copy plasmid produced 1.4 - 2.0 times more lycopene than cells expressing dxs only. However, at higher arabinose concentrations lycopene production in cells expressing both dxs and dxr was lower than in cells expressing dxs only. A comparison of the three E. coli strains transformed with the arabinose-inducible dxs on a medium-copy plamid revealed that lycopene production was highest in XL1-Blue.