• Archives of Pharmacal Research
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• 제21권4호
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• pp.470-474
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• 1998

A kanamycin producer, Streptomyces kanamyceticus IFO 13414 is highly resistant to kanamycin. Cloning of the kanamycin resistance genes in S. lividans 1326 with pIJ702 gave several kanamycin resistant transformants. Two transformants, S. lividans SNUS 90041 and S. lividan. SNUS 91051 showed similar resistance patterns to various aminoglycoside antibiotics. Gene mapping experiments revealed that plasmids pSJ5030 and pSJ2131 isolated from the transformants have common resistant gene fragments. Subcloning of pSJ5030 gave a 1.8 Kb gene fragment which showed resistance to kanamycin. Cell free extracts of S. lividans SNUS 90041, S. lividans SNUS 91051 and subclone a S. lividans SNUS 91064 showed kanamycin acetyltransferase activity. The detailed gene map is included.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제6권3호
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• pp.219-220
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• 1996

The pKH2 isolated from the multidrug-resistant Staphylococcus aureus SA2 is a 40.98-kb plasmid and mediates resistance to ampicillin, clindamycin, erythromycin, kanamycin, and streptomycin. The 3.4-kb HindIII fragment conferring kanamycin resistance was cloned from the pKH2 into pBluescriptII $KS^+$ and partial sequence determination of that fragment was carried out. Sequence analysis revealed that the kanamycin resistance gene which encoded aminoglycoside 3'-phosphotransferase was linked to the streptothricin resistance gene. But a nonsense mutation was found in the streptothricin resistance gene and this mutation resulted in a truncated protein of streptothricin acetyltransferase. Homology comparison with nucleotide sequence databases revealed that the 3.4-kb HindIII fragment of pKH2 had been derived not from S. aureus but from Gram-negative Campylobacter coli.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제15권2호
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• pp.346-353
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• 2005

A 50-kb chromosome DNA region was isolated from Streptomyces kanamyceticus by screening the fosmid genomic library, using the 16S rRNA methylase gene (kmr) as a probe. Sequence analysis of this region revealed 42 putative open reading frames (ORFs), which included biosynthetic genes such as genes responsible for 2-deoxystreptamine (2­DOS) biosynthesis as well as genes for resistance and regulatory function. Also, the kanamycin acetyltransferase gene (kac) was characterized by in vitro enzyme assay, which conferred E. coli BL21 (DE3) with 10, 50, and 80-times higher resistance to kanamycin A, tobramycin, and amikacin, respectively, than the control strain had, thus strongly indicating that the isolated gene cluster is very likely involved in kanamycin biosynthesis. This work provides a solid basis for further elucidation of the kanamycin biosynthesis pathway as well as the productivity improvement and construction of new hybrid antibiotics.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권2호
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• pp.147-153
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• 2008

국화에 담배거세미 나방 (tobacco cutworm; Spodoptera litura)에 저항성을 나타내 국화를 육성하기 위하여 cry1Ac 유전자를 형질전환하였다. Cry1Ac 유전자는 pCAMBIA2301를 포함하는 Agrobacterium C58C1을 통하여 국화 'Linneker salmon'에 도입하였다. Agrobacterium C58C1을 접종한 후 엽절편을 10 mg/L kanamycin이 함유된 재분화 배지 (MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA)에서 1차 선발을 하였고, 재분화 배지에 20 mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 2차 선발을 하였으며, 20 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 3차 발근선발을 하였다. 3차 발근선발까지 69개의 신초 (1.6%)가 생존하여 발근하였다. NptII primer로 PCR을 한 결과 그 중 36개의 신초 (0.8%)가 putative transformant로 확인되었고, Southern 분석을 한 결과, 35개체 (0.8%)가 nptII 유전자와 cry1Ac 유전자를 가진 형질전환체로 확인되었다. Cry1Ac 유전자의 형질전환율은 0.8%로 양호하였다. 온실에서 담배거세미 나방에 대한 저항성을 검정한 결과, 3개체의 형질전환체가 저항성을 나타내는 것으로 확인되었다.

• Plant Biotechnology Reports
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• 제4권4호
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• pp.293-301
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• 2010

The feasibility of two strategies for transgene pyramiding using Agrobacterium-mediated transformation was investigated to develop a transgenic potato (Solanum tuberosum L. cv. Iwa) with resistance to potato tuber moth (PTM) (Phthorimaea operculella (Zeller)). In the first approach, cry1Ac9 and cry9Aa2 genes were introduced simultaneously using a kanamycin (nptII) selectable marker gene. The second approach involved the sequential introduction (re-transformation) of a cry1Ac9 gene, using a hygromycin resistance (hpt) selectable marker gene, into an existing line transgenic for a cry9Aa2 gene and a kanamycin resistance (nptII) selectable marker gene. Multiplex polymerase chain reaction (PCR) confirmed the presence of the specific selectable marker gene and both cry genes in all regenerated lines. The relative steady-state level of the cry gene transcripts in leaves was quantified in all regenerated lines by real-time PCR analysis. Re-transformation proved to be a flexible approach to effectively pyramid genes for PTM resistance in potato, since it allowed the second gene to be added to a line that was previously identified as having a high level of resistance. Larval growth of PTM was significantly inhibited on excised greenhouse-grown leaves in all transgenic lines, although no lines expressing both cry genes exhibited any greater resistance to PTM larvae over that previously observed for the individual genes. It is anticipated that these lines will permit more durable resistance by delaying the opportunities for PTM adaptation to the individual cry genes.

• 식물조직배양학회지
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• 제28권4호
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• pp.197-200
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• 2001

상추에 제초제 저항성을 도입하기 위해 상추 자엽 조직을 NPTII-GUS 및 제초제 저항성 유전자 (PAT)가 삽입된 A. tumefaciens MP 90과 2일간 공동배양한 다음 0.1 mg.L$^{-1}$ NAA, 1.0 mg.L$^{-1}$ 2ip, 50 mg.L$^{-1}$ kanamycin, 500 mg.L$^{-1}$ carbenicillin을 첨가한 MS배지에 배양하여 식물체를 재분화시켰다. 재분화 식물체는 kanamycin 내성 검정을 통해 NPTII 유전자의 도입과, PCR, Northern blot 분석을 통해 제초제 저항성 유전자가 식물체의 게놈상에 삽입된 형질전환체임이 확인되었다. 또한 1500배액의 농도로 Basta를 살포한 결과 살포 10일 후 대조 식물체는 완전히 고사하는 데 반해 형질전환체는 지속적인 생육을 보여 얻어진 형질전환 상추가 제초제 저항성 개체임이 확인되었다.

• KSBB Journal
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• 제5권3호
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• pp.247-253
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• 1990

고등식물의 형질전환용 유전자운반체로써 가장 많이 사용되고 있는 Ti-plasmid를 이용해서 당근세포를 형질 전환시키기 위한 연구의 일환으로 Agrobacterium spp를 helper로 이용하여 NPT II gene를 함유하고 있는 binary vector GA472를 당근세포에 삽입시켜 kanamycin에 대해 저항성을 나타내는 세포주를 선발하고자 본 연구를 수행하였다. 국내 토양에서 선발한 A.tumefaciens 2종과 disarmes된 PC2760 그리고 hypervirulent균주인 A281에 tri-parental mating 방법에 의해서 binary vector인 pGA472을 도입하여 transconjungants인 A. tumefaciens c-23-1/pGA472,K29-1/pGA472, PC2760/PGA472 그리고 A281/pGA472를 획득하였다. Transconjungants는 plasmid의 분리, 정제방법에 의해서 추출한 후 0.7% agarose gel 상에서 관찰해 본 결과 4균주 공히 NTPII gene이 삽입된 pGA472와 Ti-plasmid를 함유하고 있는 것을 확인 하였다. 확인된 conjugant와 당근정상조직을 동시배양방법에 의해서 형질전환을 유도한 후 정상조직은 전혀 생존이 되지않은 kanamycin에 대해서 저항을 나타내는 callus를 선발할 수 있었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제28권5호
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• pp.243-248
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• 2001

본 실험은 nptII 및 hpt 유전자가 삽입된 현사시나무를 이용하여 각 항생제 저항성 유전자로 형질전환된 세포의 효율적인 선발 조건을 규명하기 위하여 수행되었다. 액아가 포함된 줄기절편과 잎절편 조직의 생장, 발근 유도, 캘러스 유도로 항생제에 대한 감수성에 대한 효과를 검정하였다. 형질전환되지 않은 대조식물체의 잎절편을 이용한 경우 50 mg/L의 kanamycin이나 2 mg/L hygromycin으로 캘러스 유도 및 생장을 억제할 수 있었으나 형질전환된 식물은 100 mg/L kanamycin, 50 mg/L hygromycin에서도 왕성한 생장을 나타냈다. 절간조직의 개아의 경우 100 mg/L kanamycin, 5 mg/L hygromycin으로 줄기신장을 완전히 억제 가능하였으며, 뿌리유도는 50 mg/L kanamycin, 5 mg/L hygromycin에서 선발이 가능하였다. 형질전환체는 모두 이보다 높은 농도에서 왕성한 생장을 보였다. 형질전환이 되지 않은 세포의 생장을 억제하는 데는 hygromycin이 kanamycin보다 더 효율이 좋은 것으로 나타났다. 따라서 hpt유전자가 npt II 유전자보다 훨씬 강력한 선발표지임이 확인되었으며 엽절편의 캘러스 유도와 생장과 절간조직의 발근유도 모두 항생제에 예민하게 작용하여 형질전환체의 식별에 효과적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

• 한국산림과학회지
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• 제79권3호
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• pp.278-284
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• 1990

우리나라에서 육성(育成)한 교잡종(交雜種)인 양황철나무에 대해 A. tumefaciens strain 6044(pGA472)에 대한 감염력(感染力)을 조사(調査)하였다. 침으로 자극(刺戟)한 양황철나무 잎에서 callus유발은 MS-2, 4-D 0.5 mg/l-BA 0.1 mg/l 배지에서 높게 나타났으며, 줄기는 MS-2, 4-D 0.1 mg/l-BA 0.2 mg/l 배지에서 많이 발생하였다. 형질전환(形質轉換)에 사용(使用)한 A. tumefaciens strain 6044는 AB 액체배지에서 OD 0.5 일때 접종하였는데 이때 박테리아의 농도(濃度)는 1ml당 $4{\times}10^8$개 였다 기내배양(器內培養)한 양황철나무옆에 대한 kanamycin 감수성(感受性)을 조사(調査)한 결과(結果) 10 mg/l에서 심한 생장(生長) 장애(障碍) 현상(現象)을 나타내어 식물체(植物體) 재분화(再分化)가 일어나지 않았다. 침으로 자극한 양황철나무 잎은 A. tumefaciens 6044와 공배양(共培養)한 후 carbenicillin 300 mg/l와 cefotaxime 200 mg/l에서 엽표면에 붙어 있는 박테리아를 제거하였다. 공배양(共培養)한 잎은 kanamycin 10 mg/l가 첨가된 배지(培地)에서 재분화(再分化)되었으며, 줄기 재분화율(再分化率)은 약 10%에 달했다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권1호
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• pp.31-36
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• 1991

Tn5의 kanamycin 저항성 유전자를 가진 pBEL1 plasmid와 C.glutamicum cryptic plasmid인 pSR1으로 7.5kb의 새로운 plasmid를 만든 후, 이를 pCE1301이라 명명하였다. 이 pCE1301은 PEG1301은 PEG-protoplast법으로 C.glutamicum을 형질전환하였을 때 효율이 약 $3.0\times 10^3$형질전환제/$\mu g$이었으며 SalI과 EcoRI 제한효소 절단부위가 1개씩이었다. 또 Km이 없는 배지에서 25세대까지 안정하게 유지되었으며 B.flavum, E.coli에서 복제되었다. 이 pCE1301을 이용하여 C.glutamicum 의 homoserine dehydrogenase 유전자를 cloning하였다.