등전점 전기영동법에 의한 동위효소 분석과 제한효소 단편 다형화현상(RFLP) 분석기법을 이용하여 보리 품종 19종의 품종형을 구분하고 근연관계를 검토하였다. 보리 19품종은 동위효소 형태특성 에 따라 esterase는 7가지형으로, phosphoglucose isomerase는 3가지형으로, peroxidase는 4가지형으로, alcohol dehydrogenase는 2가지 형으로 각각 분류되었으며, 그 핵 DNA를 제한효소 EcoRV로 절단하여 DNA probe pMSU 71로 RFLP를 분석한 결과 2가지 품종형으로 구분되었다. 이 4가지 동위효소의 형태특성 및 핵 DNA의 RFLP 특성을 종합하면 보리 19품종을 13가지 품종형으로 구분할 수 있었다. 이렇게 구분된 13가지 품종형들은 Nei's F-statistics의 계산식으로 그 근연관계를 분석하였더니 $97.4{\sim}66.5%$ 범위의 근연관계를 보였다.
Erythropoietin (EPO) is mainly produced in kidney and stimulates erythropoiesis. The use of recombinant EPOs for doping is prohibited because of its performance enhancing effect. This study investigated whether biosimilar EPOs could be differentiated from endogenous one by iso-electro-focusing plus double blotting and SDS-PAGE for antidoping analysis. The established method was validated with positive control urine. The band patterns were reproducible and meet the criteria, which was made by world anti doping agency (WADA). Isoelectric focusing was conducted in pH range 2 to 6. Recormon (La Roche), Aropotin (Kunwha), Epokine (CJ Pharm Co.), Eporon (Dong-A), Espogen (LG Life Sciences), and Dynepo (Shire Pharmaceuticals) were detected in basic region. All biosimilars showed discriminative isoelectric profiles from endogenous EPO profiles, but they showed different band patterns with the reference one except Epokine (CJ Pharm Co.). Next, SDS-PAGE of biosimilar EPOs resulted in different molecular weight patterns which were distributed higher than endogenous EPO. Commercial immune assay kit as an immune affinity purification tool and immobilized antibody coated magnetic bead were tested for the purification and concentration of EPO from urinary matrix. The antibody-coated magnetic bead gave better purification yield. The IEF plus double blotting and SDS-PAGE with immunoaffinity purification method established can be used to discriminate biosimilar EPOs from endogenous EPO.
한국 재래종 대두(Glycine max) 943계통과 강원도 지성 수집종 야생종(G.soja) 50계통을 polyacrylamide gel electrophoresis와 isoelectric focusing 전기영동으로 LAP 동립효소를 분석한 결과를 요약하면 다음과 같다. PAGE에 의한 Lap1*b는 재래종과 야생종에서 가장 흔한 대립인자였다. Lap1*b의 대립인자 빈도는 한국 야생종(0.94)에서보다 재래종(1.00)에서 더 높았다. 이러한 결과는 한국 재래종 대두는 Lap1 유부자좌에서 Lap1*b 대립인자로 고정되어 있음을 나타내는 것이다. IEF 전기영동법을 이용하여 pH 4∼6.5의 gel에서 LAP 동립효소의 band type을 확인한 결과 재래종과 야생종에서 I type과 II type의 band type을 확인하였다. 재래종과 야생종에서 II type이 6계통(7.2%)과 4계통(8.0%)으로 각각 나타났고 I type은 79계통(92.8%)과 46계통(92.0%)으로 각각 나타났다. 이러한 결과는 다양한 band type이 나타날 수 있는 가능성을 제시하고 있다.
한국에 자생하는 느타리버섯 균주중 지역별로 기주가 다른 균주들을 수집하여 Esterase 동위효소와 Leucine amino peptidase 동위효소를 등전점 전기영동으로 균사와 자실체 부위별로 비교하였다. Pleurotus ostreatus의 Esterase 밴드 패턴은 균사와 자실체가 많은 차이가 있었으나 자실체중 Primordia, 갓, 줄기 등의 isozyme 패턴은 유사하였다. P. ostreatus, P. cornucopiae, P. florida의 Esterase 밴드 패턴에 많은 차이가 있어 종간 균주구별이 가능하였다. Leucine Amino Peptidase 밴드는 P. ostreatus, P. cornucopiae, P. florida 간에 뚜렷이 구별지을 수 없었으며, 균사와 자실체 간에는 약간의 밴드 패턴의 차이가 있었다.
서로 비슷한 어종으로 약간의 저차 가공시에도 육안적 규별이 어려운 12개 어종의 등전점 전기영동 결과는 다음과 같다. 3종의 갑각류에서 대하와 중하는 밀새우와 다른 단백질 pattern이 pH 4.5 이하에서와 pH 5~7.5에서 서로 구별이 가능하였으며, pH 범위를 변경했을때, 중하와 대하 사이의 구별은 pH 5 부근에 있는 단백질띠로 나타났지만 크기나 형태적으로 거의 같은 대하의 치어에 대한 조사가 필요한 것으로 생각되었다. 민어속 어류에서도 참조기와 항강달이는 비슷한 등전점을 가지는 단백질의 분포가 pH 5~8 사이로 나타났다. 이 분포대에서 돌가자미와 도다리에서도 비슷한 현상을 보였으며, pH 6~7, pH 8~9 범위에서 박대와 도다리는 서로 다른 단백질 분포를 보였고, 참가자미와 돌가자미는 pH 4.5, pH 6.0과 pH 8.0이하에서 뚜렷이 다른 분포를 보였다. pH범위를 변경하여도 단백질 pattern의 구별이 어려운 참조기와 황강달이에서의 2차원 전기영동은 pH 5.0rhk pH 6.0부근에 있는 단백질들에서 추정분자량 11,700과 87,000으로서 등전점 전기영동시 pH 범위 변경 및 2차원 전개 전기영동을 병용할 경우 서해산 어종(중하, 대하, 밀새우, 참조기, 수조기, 황강달이, 참가자미, 도다리, 박대, 돌가자미, 병어, 아홉등가리)의 판별에 구성 단백질의 등전점 전기영동이 신속하고 효과적임을 알 수 있었다.
Trichoderma sp. C-4의 배양액으로부터 한 종류의 endoglucanase(F-II-II)를 Sephacryl S-200 및 Sephacryl S-100 chromatography를 통하여 분리하였다. 분리된 효소는 SDS-PAGE및 isoelectric focusing을 통하여 단일 band로 나타났으며, 분자량이 26,000, 등전점이 8.0으로 나타났다. 이 효소의 반응 최적온도와 최적 pH는 각각 $50^{\circ}C$, 5.0 이었으며, $50^{\circ}C$에서 24시간 동안 안정하였다. 분리된 효소의 carboxymethylcellulose에 대한 specific activity는 776.2 U/mg protein으로 나타났다. 이 효소의 아미노산 조성을 조사하였다. 효소를 trypsin으로 가수분해한 후 분해산물에 대한 단백질서열 분석을 행하였다. 그 결과 이 효소의 서열은 현재까지 밝혀진 다른 단백질과 homology를 갖지 않음이 확인되었다. 이 효소는 그 specific activity가 대단히 높고 아직 보고되지 않은 novel protein일 가능성이 대단히 높기 때문에 좋은 유전자 자원이 될 것으로 사료되었다.
토란에서 정제한 lectin은 적혈구 응집활성이 서로 다른 4개의 획분 (Isolectin I, II, III, IV)으로 이루어진 당단백질로서, disk 전기영동 및 densitometric pattern 상에서 I, IV는 단일한 subunit의 단백질로서, 그리고 II, III는 I, IV는 단일한 subunit의 단백질로서, 그리고 I, II는 I, IV의 fabric 단백질로서 추정되었다. 그러나, 요소 함유 disk 전기영동에서는 I은 단일의, IV는 2종류의 subunit에서, II, III은 I, IV의 subunit에서 구성된 단백질임을 알앗다. 그래서 염소함유 초점전기영동에서도 isolectin IV는 2개의 peack가 될 것이라고 예상하였으나 실제로는 1개의 peak만이 나타났다. 또한 정제 lectin은 당, 가열, pH, 변성제, 금속에 대한 적혈구 응집저해는 거의 보이지 않았으나, pepsin에 의한 부분적인 활성 변화가 관찰되었다.
The soybean $\beta$-amylase ($\alpha$-1, 4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2) is composed of seven isozymes(I', I, II, III, IV, V and VI), and isozyme II and IV are the main components among these. The Purification of $\beta$-amylase isozymes from soybean whey were performed by ammonium sulfate fractionation, CM-Sephadex C-50 column chromatography, DEAE-Sephadex chromatography and Gel filtration. The resulted purity of $\beta$-amylase was throughly confirmed by electrophoresis, and then determined its isoelectric point and molecular weight. The results obtained were as follows, 1. Five active fractions of soybean p-amylase were derived on CM-Sephadex C-50 column chromatography. 2. Seven active bands of p-amylase isozymes were detected by isoelectric focusing gel electrophoresis, and their isoelectric points(I' to VI) were 5.07, 5.15, 5.25, 5.40, 5.55, 5.70 and 5.93, respectively. 3. Isozyme II and IV were main components of soybean $\beta$-amylase. 4. The molecular weights of both isozyme II and IV were determined to be 56,000 daltons by the result of SDS polyacrylamide gel electrophoresis. 5. Km values of main isozyme II & IV for amylopectin were determined to be 2.25 mg/ml, which suggest the same function of each isozyme.
Streptomyces fradiae protease inhibitor (SFI) was purified effectively by preparative isoelectric focusing and hydroxyapatite chromatography. The molecular weight of SFI was estimated to be 1.7 kDa by SDS-PAGE and 1.8 kDa by molecular sieving HPLC. One hundred and sixty amino acid residues were determined from which molecular weight of SFI was calculated to be 17.054 Da and carbohydrate residue was not detected. SFI was calculated to be 17,064 Da and carbohydrate residue was not detected. SFI was a monomeric protein with two reactive sits, of which isoelectric point was pH 4.1. N-terminal amino acid sequence of SFI had homology with SSI (Streptomyces subsilisin inhibitor) and other protease inhibitors produced by Streptomyces.
To identify the activity of recombinant subtilisins (subtilisin BPN' and subtilisin Carlsberg), three different zymography methods, SDS-fibrin zymography (SDS-FZ), reverse fibrin zymography (RFZ), and isoelectric focusingfibrin zymography (IEF-FZ), were used. The recombinant subtilisins BPN' and Carlsberg did not migrate into the electrophoretic field based on a Laemmli buffer system, instead forming a "binding mode" at the top part of the separating gels with the SDS-FZ and RFZ techniques. Yet, this problem was resolved when using IEF-FZ with a pH range from 3 to 10. In addition, all these methods enabled the activity of a recombinant pro-subtilisin DJ-4 to be detected without a refolding pathway.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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