고려 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)중의 invertase를 연구하기 위하여 조(租) 인삼 invertase를 분리 조제하여 그 성질을 조사해 본 결과 다음과 같았다. 1. 조 인삼 invertase는 ammonium sulfate $0.8{\sim}1.0$포화 분획에 의하여 효과적으로 조제되었다. 2. 조 인삼 invertase는 pH $5{\sim}9\;35^{\circ}C$이하의 조건에서 안정성을 나타내었다. 3. 조 인삼 invertase는 최적 pH 5.0, 최적온도 $50^{\circ}C$를 나타내었다. 4. 조 인삼 invertase는 $Ag^{+}\;Mn^{+}\;Hg^{+}\;Zn^{+}\;Rb^{+}$등의 금속 이온에 의하여 저해되었으나 그 저해 정도는 크지 못하였다. 한편 $Ca^{+}\;Cu^{+}\;Fe^{3+}$등에 의한 효소 활성 증대 효과는 특이적이었다.
Sucrose에 의한 재조합 Saccharomyces cerevisiae의 invertase 생성 양성을 이단계 배양을 통하여 관찰하였다. 포도당 배지에서 SUC2 유전자의 발현이 억제된 상태에서 발현배지의 sucrose 농도가 2$g/\ell$일 경우 invertase 최대 비역가는 10 units로 5$g/\ell$보다 40% 향상된 값을 보여주었다. 발현배지에서의 당의 농도변화와 invertase 발현은 서로 대응관계가 있음을 발견하였다. 초기에는 SUC2 유전자가 발현되어 invertase가 생성 분비되어서 배지중 sucrose를 포도당과 과당으로 분해하였다. 분해된 포도당의 농도가 2$g/\ell$ 이상이 되면 invertase 생성은 다시 억제되었다. 동시에 미생물에 생육에 의해 포도당 농도가 2$g/\ell$이하로 감소되면서 다시 invertase 생성이 유도되었다. 이러한 현사은 5$g/\ell$의 sucrose 배지에서 더욱 현저하게 관찰 할 수 있었다. 발현배지의 온도를 $35^{\circ}C$증가시켰을 경우 invertase 생성은 $30^{\circ}C$보다 약 1.7배만큼 증가하였다.
고온성이며 호알칼리성인 Bacillus sp. TA-11이 생성하는 Invertase의 생합성 조절 기작을 규명하고자 먼저 이들의 유도와 억제에 관하여 검토하였다. Invertase는 10mM sucrose을 함유한 생합성 조절배지에서 3시간에 효율적으로 유도되었고 glucose는 sucrose에 의한 invertase 유도를 inducer exclusion 방식으로 억제시켰다. CAMP의 첨가로 glucose에 의한 catabolic repression이 다소 줄어들었다.
서로 다른 성접합형 A와 a를 가지는 Rhodosporidium toruloides가 생산하는 invertase를 조사한 결과, 접합형 A는 세포내, 세포벽 결합, 세포의 분비성 invertase의 3가지를 생산하였으나, 접합형 a는 세포외 invertase를 생산하지 않는 접합형 특이성이 있는 것을 알았다. 양 접합형 세포로부터 세포내 invertase를 부분정제하여 이들의 성질을 비교한 결과, 접합형 A세포 유래의 효소는 $Zn^{2+}$에 의하여 11의 활성 상승효과와Mn^{2+}$에 의한 42.2%의 감소를 보이는 반면, a세포 유래의 효소는 $Mn^{2+}$에 의한 15의 활성 감소만을 보였다. 효소 저해제의 효과에서 a세포의 invertase는 2-mercaptoethanol, sodium dodecyl sulfate, pheonl에만 약간 저해를 받을 뿐이었다. 이들 양 효소의 열안정성은 모두 $80^{\circ}C$ 이상에서 급격히 실활되는 양상을 보였으며 최적 온도가 $60^{\circ}C$로 둘다 비슷하였다. a세포 유래의 invertase는 pH 3에서 pH 10까지 넓은 pH의 범위에서 안정하며 최적 pH가 4.0인반면, A 세포의 invertase는 pH 3에서 pH 6까지 산성의 조건에서만 안정하였으며 최적 pH는 5.0으로 나타났다.그리고, A 세포와 atpvh 유래 invertase의 $K_m$값은 각각 $2.5{\times}10^3$M 과 $3.4{\times}10^3$M과 이였다.
세포내와 세포벽에 invertase가 존재하며 catabolite inhibition을 받지않고 세포외로 구성적으로 invertase를 생산하는 Rh. glutinis K-24를 공시균주로 선택하여 세포내와 세포벽 invertase를 정제한 후 정제효소의 효소화학적 성질을 밝혔다. 세포내 invertase는 DEAE-Sephadex A-50에 의한 Batchment, DEAE-Sephadex A-50 column chromatography, gel filtration on Sephadex G-200, isoelectric focusing 등의 조작에 의해 Disc 전기영동상 단일한 효소단백질까지 정제되었다. 세포벽 invertase는 B. pumilis에 의해 생산되는 세포벽 용해효소를 작용시켜 invertase를 용출 시킨 다음 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography, gel filtration on Sephadex G-100의 조작에 의해 부분 정제하였다. 세포내와 세포벽 Invertase의 분자량은 각각 약 310,000과 67,000이었고 세포내 경우는 subunit 분자량이 약 70,000이었다. 세포내와 세포벽 효소의 반응 최적 pH와 온도는 모두 4.0와 6$0^{\circ}C$였으며 온도 안정성도 7$0^{\circ}C$까지 거의 비슷하게 나타났다. 그러나 Km값은 세포내 효소의 경우는 4.3x$10^{-3}$M이었고 세포벽 효소의 경우는 2.1x$10^{-2}$M이었다. 그외 Inhibitor에 대한 효소의 저해양식도 양효소에 비슷한 결과를 나타내었다.
본 연구는 몇 가지 생장억제제를 배지에 처리하였을 때 기내 배양한 나도풍란 유묘의 생장과 그들의 invertase활성 검정을 위하여 실시하였다. 나도풍란에 식물생장억제제 인 ancymidol과 paclobutrazol을 각각 배양용 배지에 첨가했을 때, 농도가 높을수록 엽장이 감소한 반면, 엽폭은 상대적으로 증가하였고, 근장은 짧았으나 근수 및 근직경은 증가하였다 Uniconazole 0.05 mg/L에서는 잎과 뿌리생장이 대조구보다 오히려 촉진되었다. 처리한 모든 종류에 있어서 그 농도가 높아짐에 따라 잎 모양은 원형으로 변하면서 작아졌다. Invertase 활성을 알아보기 위 한 soluble acid invertase 활성과 soluble alkaline invertase활성은 잎에서는 생장억제제 농도가 낮은 처리에서 높았고, 뿌리에서는 정반대의 경향이었다. 지상부 및 지하부의 전분함량은 잎에서는 invertase 활성이 높았던 저농도에서 높았으며, 뿌리에서는 invertase 활성이 높았던 고농도에서 높았다.
호알칼리성이며 고온성인 Bacillus sp. TA-11이 세포내로 생성하는 invertase 유전자를 대장균에 클로닝 시켜 얻은 재조합 E. coil pYC17의 invertase 생합성 조절양상을 조사 하였다. 재조합 E. coil의 invertase는 30 mM sucrose에 의해 3시간에 가장 효과적으로 유도 되었으며 조합 E. coil pYC17의 sucrose에 의한 invertase 유도는 10 mM의 glucose 농도에서 심하게 억제 되었다. 이러한 재조합 E. coil pYC17에서의 invertase 생합성 조절 양상은 친주인 Bacillus sp. TA-11과 유사하였으나 저해농도는 낮았다.
호 알칼리성이며 고온성인 Bacillus cereus TA-11이 세포내로 생성하는 invertase의 생합성 조절 양상을 조사하였다. Bacillus cereus TA-11의 세포내 invertase는 10 mM sucrose의 180분 처리와 25 mM raffinose의 90분 처리에서 각각 효율적으로 유도되었다. 또한 glucose는 sucrose에 의한 invertase의 유도를 억제하였고 cAMP첨가는 catabolite repression을 감소시키지 못하였다.
SUC2 유전자를 가진 재조합 Saccharomyces cerevisiae의 invertase 생산성을 향상시키기 위하여 균체 생육과 유전자 발현에 미치는 아미노산과 용존산소 농도의 영향을 연구하였다. 균체 생육과 invertase 발현에 적합한 leucine과 histidine의 최적 첨가량은 탄소원인 포도당에 대한 비율로서 나타내어 0.03g/g glucose와 0.04g/g glucose였다. 회분배양에서는 통기량이 적을수록 invertase 비활성이 증가하였다. 희석율 0.09h에서 용존산소농도를 조절한 연속배양에서는 요존산소농도가 감소함에 따라 유전자 발현이 잘되어 5 포화 이하일때 invertase 비활성이 급격히 증가하여 통기를 하지 않은 조건에서 125.54KU/g cell의 최고 비활성을 얻었다.
A novel process was developed to simultaneously produce invertase and yeast extract from baker's yeast using ultrafiltration (UF) and microfiltration (MF) membrane processing. After the extraction of invertase under the optimal condition obtained in this study, invertase was separated from yeast cells using a hollow fiber membrane with a pore size of 0.1 $\mu\textrm{m}$. The resulting permeate containing invertase was concentrated using a hollow fiber membrane with a nominal molecular weight cut-off of 30 kDa. The yeast cell and permeate solutions, which were obtained after MF and UF membrane processing, respectively, were mixed together, and the autolysis was performed at 50$^{\circ}C$ in the presence of 5% (w/v) ethanol and 1% (w/v) NaCl. As a result, the yeast extract and invertase could be simultaneously produced from baker's yeast by this novel process.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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