This study was conducted to investigate the crossability, seed dormancy and overwintering ability of rice plant in GM (glufosinate ammonium-resistant lines. Iksan 483 and Milyang 204) and non-GM (their parents) or red rice (Andongaengmi). Seed-setting rate was not significantly different between GM and non-GM rice varieties. Iksan 483 and Milyang 204 showed the similar level of seed germination rate from 30 to 50 days after heading as compared to non-GM rice varieties. After overwintering in paddy field, seed germination rate of GM and non-GM rice varieties ranged from 14.3 % to 57.6 % in dry soil condition, but there was no germination in wet-soil except red rice. The result in wet-soil condition may help to set up a strategy for reducing the risk of gene flow of transgene via dispersal of seeds of GM plants. The crossability, seed dormancy and seed overwintering of Iksan 483 and Milyang 204, herbicide resistant GM rice varieties, were not significantly different compared to non-GM rice varieties. The results might be helpful to reduce the risk of transgene dispersal from GM crop via seeds and pollens.
Transgenic plants with the herbicide-resistance gene (bar gene) were obtained via organogenesis from isolated mesophyll protoplasts of Nierembergia repens after applying electroporation. Transient ${\beta}-glucuronidase$ (GUS) activity of electroporated protoplasts assayed 2 days after applying an electric pulse showed that optimum condition (transient GUS activity 319 pmol 4 MU/mg per min and plating efficiency 2.43%) for electroporation was 0.5 kV/cm in field strength and $100{\mu}F$ in capacitance. The protoplasts electroporated with the bar gene at this condition initiated formation of microcolonies on medium after 2 weeks. After 4 weeks of culture, equal volume of fresh 1/2-strength Murashige and Skoog (MS) medium containing 0.2 mg/l bialaphos was added for selection of transformed colonies. After 6 weeks of culture, growing colonies were transferred onto regeneration medium containing 1.0 mg/l bialaphos, on which they formed adventitious shoots 1-2 months after electroporation. The adventitious shoots rooted easily after transfer onto MS medium with bialaphos lacking plant-growth regulators. Transformation of these regenerants with the bar gene was confirmed by Southern analysis. Some of the transformants showed strong resistance to the application of bialaphos solution at 10.0 mg/l.
35S cauliflower mosaic virus 프로모터의 조절을 받고 인트론이 포함된 β-Glucuronidase (gus) gene과 35S cauliflower mosaic virus (enhanced) 프로모터의 조절을 받는 blpR유전자가 있는 pCAMBIA3301 벡터가 포함된 AGL-1 균주를 사용하였다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환 체계와 PPT (D-L-phosphinothricin) 선발을 통하여 나리 인편조직으로부터 형질전환 식물체가 획득되었다. 본 연구에서 나리 레드플레임'품종의 인편조직에 선발 및 목적유전자로 바스타 제초제저항성 유전자인 blpR 유전자를 도입하였다. 상기 실험 결과, 20분의 접종시간과 5일간의 아그로박테리움과의 공동배양이 100개의 접종된 인편개체에서 각각 24, 27개의 높은 PPT 저항성 개체가 관찰되었고 신초까지 형성된 인편을 19.6 및 22.7개를 생산하는 우수한 형질전환 결과를 보여주었다. 이렇게 제초제를 이용하여 선발되었을 뿐만 아니라 도입된 reporter 유전자인 gus도 발현되었음을 확인하였고 선발유전자이자 목적유전자인 blpR 유전자도 PCR 검정을 통해 도입되었음을 확인하였다. 12주 이상의 선발과정을 거치고 gus 및 PCR 검정을 거친 형질전환 개체들은 발근 배지를 거쳐 순화 후 화분으로 이식하여 높은 활착율을 보여주었다. 결론적으로 본 연구에서 확립한 프로토콜을 이용하면 평균 20% 이상의 형질전환 효율을 나타내고 본 연구에 기술된 아그로박테리움 매개 형질전환 체계에 향후 보완이 필요하지만, 우수 품종개발을 위한 나리 육종 프로그램에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
형질전환 식물체를 직접 이용하기에는 후대에 유전적인 고정 및 포장검정이라는 문제가 대두되는데, 이를 해결하기 위하여 본 연구는 바스타저항성 유전자가 도입된 벼와 직파적 응성 계통을 교잡한 후 약배양에 의한 형질전환체 고정 등 기존 육종체계와 연계하여 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성할 수 있는 체계를 확립하고자 수행하였다. 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성하고자 1999년 동계에 교배된 동진벼 Ds15(Ba $r^{R}$)/주남벼 등 5조합으로부터 2000년 $F_1$을 양성하고, 이들을 PCR분석으로 제초제 저항성 유전자 bar도입을 확인한 후 약배양을 실시하여 얻어진 1,508개의 재분화 식물체 중 제초제 저항성 유전자가 도입된 169개체 ( $A_2$)에서 채종하였다. 이들을 2001년 포장에 공시하여 42계통을 선발하고,2002년에 동진벼 Ds15 (Ba $r^{R}$)/주남벼 조합에서 수량 등 주요 농업형질이 우수한 7계통을 생산력 검정시험에 공시한 결과 제초제 저항성이면서 직파적응성 등 기타 농업형질이 우수한 YR23235Acp79를 선발하여 밀양 204호로 계통명을 부여하였다. 결과적으로 형질전환체를 이용하여 교배부터 계통선발까지 3년 만에 목적하는 계통을 조기에 육성할 수 있는 생력육종체계가 확립되었다.
인삼의 자엽과 callus에 Biolistic system을 이용한 비선택성 제초제인 bialaphos에 대한 내성을 갖게 하는 PAT 유전자의 형질전환효율 향상 및 형질전환체의 유전분석에 관한 실험을 수행하였다. 자엽의 경우에는 형질전환율이 약했지만 callus의 경우에는 target distance 9 cm, rupture disk-macro-carrier gap distance를 1/3"로 했을 때 가장 양호한 형질전환 결과를 보였다. 형질전환된 인삼식물체에서 PAT 및 NPT 유전자의 존재 여부를 확인하기 위해서 PCR을 수행한 결과 정상 식물체서는 전혀 PCR product가 형성되지 않은 반면 형질전환체 모두에서 PAT (약 300 bp)와 NPT (약 800 bp) 유전자의 band를 확인하여 각각의 유전자가 삽입되어 PAT 및 NPT IIgene이 도입된 형질전환체임을 확인할 수 있었다. 있었다.
Haploid system by anther culture allows the development of homozygous lines when doubled. The response of anther culture to Basta (glufosinate) resistance was investigated on transgenic plants (cv. Anjungbyeo) in order to identify inheritance of bar gene associated with Basta. Most of the regenerated transgenic plants were sterile, and only a few plants produced viable seeds ($A_1$) in the greenhouse. The bar gene was analysis by PCR in basta resistant transgenic plant ($TA_0$). The transgenic seeds ($A_1$) were significantly germinated in Basta solution compared with non-transformed seeds. As a result of anther culture, in regenerated haploid plants, segregation ratio was 1:1 in five of eight cross combinations. In diploid plants, segregation ratio was 1:1 in seven of eight cross combinations. Although there was some differences in the cross combinations, most of the combinations had 1:1 segregation ratio which supports the theory. The difference may be a result of the small sample size or the difference of anther culture response caused by genotypic difference. Hence, when many cross combinations were anther-cultured the results would support the theory.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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