• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권6호
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• pp.716-721
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• 1999

It has been known that continuous cultivation of hairy root is difficult to maintain for a long period of time compared to the microbial and callus cultures. Chemostat cultivation was successfully carried out in order to economically produce a plant-based colorant, betacyanin, from red beet hairy root for more than 85 days in a 14-1 fermentor. The result from the chemostat cultivation was compared to those of the batch and fed-batch cultivations of red beet hairy roots. It was shown that hairy root reached its steady state within 50 days of the cultivation, and then maintained for about 25-30 days in a wide range of dilution rates. Total betacyanin production from the continuous process was also calculated to be 2.65g at 0.28(l/d) of dilution rate, compared to 0.196g from fed-batch cultivation. It was found that betacyanin production was a partially growth related process, yielding 0.376 mg/g-fresh wt. cell and $1.89{\times}10^{-5}$ mg/g-fresh wt. cell/d, with 0.92 of correlation factor in a partial growth-product model. It was also shown that the cell growth required was relatively large for maintenance amount of energy at a low dilution rate. The growth of hairy root was inhibited by high light intensity in following a photo-inhibition model. The growth parameters were estimated to be 0.3(l/d), $10.56kcal/\textrm{m}^2/h$,{\;}and{\;}35.81kcal/\textrm{m}^2/h$ for the maximum specific growth rate, half saturation light intensity, and inhibition light intensity, respectively.

• 자연과학논문집
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• 제4권
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• pp.103-142
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• 1991

표식 유전자를 이용하여 체세포 잡종체를 선발하기 위한 연구의 일환으로 감자조직에는 T-DNA를 도입하여 식물호르몬 무첨가 배지에서도 생장가능한 형질전환체을 획득하고, 담배조직에는 NPT H gene을 도입하여 kanamycin에 대해서 저항성을 나타내는 형질전환체를 획득하여 각각의 특성구명과 원형질체를 유리하여 도입된 유전자 marker를 이용해서 융합을 시도한 바 그 결과는 다음과 같다. 1. 감자 괴경에서 Agrobacterium tumefaciens Ach5와 A. rhizogenes ATCC15834를 접종하여 crown gall tumor 및 hairy root를 유기하였으며 이러한 tumor조직은 식물 호르몬 무첨가 배지에서 생장이 가능하였다. 2. 감자에서 유기된 hairy root로부터 callus 형성은 2.4-D 2mg/1 첨가된 MS 배지에서 가장 양호하였으며 casein hydrolysate 1g/1가 첨가하면 유연 한 callus의 증식이 더욱 왕성하였다. 3. Activated charcoal이 0.5~2.0g/1 첨가된 배지에서는 crown gall tumor callus의 절단면이 갈변되는 것을 방지 할 수 있어 생존률을 높일 수 있었으나 hairy root에서는 갈변되어 고사되었다. 4. 2, 4-D 2mg/1와 casein hydrolysate 1g/1를 첨가한 배지에 hairy root callus를 현탁배의한 결과 양호한 많은 callus 덩어리들을 단시간에 얻을 수 있었다. 5. $Tri^-$parental mating으로 NPTII gene이 coding되어있는 binary vector인 pGA643을 wild type 및 disarmid된 Agrobacterium 내에 도입하여 Agrobacterium tumefaciens Ach5/pGA643, A.tumefaciens $A_4T$/pGA643, A. tumefaciens LBA4404/pGA643를 획득하였다. 이 세 개의 conjugant를 사용하여 0.7% agarose gel 상에서 pGA643을 확인하였다. 6. pGA643이 도입왼 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와 담배 조직과 동시배양하여 kanamycin $100\mug$/ml 첨가된 배지에 생존하는 callus를 선발하였으며 동일배지에서 callus의 증식이 가능하였다. 7.형질전환된 담배 callus로부터 식물체 형성은 BA 2mg/1를 첨가한 배지에서 가능하였다. 8. 재분화된 담배의 엽조직은 kanamycin.이 $1000\mug$/ml 첨가된 MS 배지에서도 왕성히 callus가 유기되어, 이는 재분화체에서도 NPTII gene이 그대로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 9. 담배의 정상 shoot와 형질전환된 shoot를 kanamycin이 $100\mug$/ml이 함유된 MS배지에 기내삽목한 결과, 정상 shoot는 발근이 되지 않고 황화 되었으나 형질전환된 shoot는 발근이되었으며 정상적으로 생장을 하였다. 10. 감자의 T-DNA가 도입된 현탁배양 callus는 cellulase 2%, macerozyme 2%, dricelase 1%에서 양호하게 유리되었다. 11. Osmoticum으로서 mannitol 농도 0.8M에서 담배와 감자의 두 조직 모두 원형질체유리가 가장 효과적이었다. 생존력은 T-DNA가 도입된 감자의 hairy root를 callus로 탈분화 시킨 후 현탁배양한 callus가 mannitol 0.5M에서 97%를 나타냈고, 그리고 NPTII gene이 도입된 담배의 엽조직은 mannitol 0.7M에서 94%로 최고를 타나냈다. 12. 원형질체 융합은 PEG solution 처리 15분 후부터 관찰되기 시작하여 20분에 완전히 융합되었고, 융합된 원형질체는 선발 marker인 호르몬 무첨가 및 kanamycin 첨가배지에서 배양 5일 후에 세포벽이 재생되었으며 4주일 후부터 colony들이 관찰되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제39권3호
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• pp.205-211
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• 2012

Pueraria lobata is a perennial legume plant, widely distributed in the countries of East Asia. It is a medicinally important leguminous plant and produces various isoflavones such as puerarin, daidzein etc which have potential for preventing several chronic diseases including osteoporosis, cardiovascular disease and cancer. In this study, we tried to induce hairy roots in vitro from Korean wild arrowroot P. lobata and investigated the effects of hormones and light conditions. Initially leaf and stem segments were infected with Agrobacterium rhizogenes and incubated in different conditions. Hairy roots were induced from only stem segments and the induction was best at dark condition and the presence of IBA during incubation. Secondary roots were also significantly much more induced at the dark condition than at the 16 hours light condition. Among plant growth regulators of auxin, IBA was best for secondary root formation while 2,4-D, IAA and NAA produced callus or less hairy roots. The presence of the foreign gene rolC transferred by A. rhizogenes that plays a major role in hairy root induction was confirmed by PCR. The accumulation of isoflavones such as puerarin and daidzin was also confirmed. These results will facilitate mass production of hairy root and can be used for the production of functional substances from wild arrowroots.

• 한국연초학회지
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• 제20권1호
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• pp.40-49
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• 1998

Protoplasts were isolated from mesophyll of tobacco(Nicotiana glauca) transformed with kanamycin-resistant gene (NPT II gene) and potato hairy root callus containing Ri plasmid of Agrobacterium rhiEogenes, and protoplasm fusion was made between the isolated protoplasts. The transgenic tobacco leaf tissue could grow on the media containing high concentrations of kanamycin, but not on the phytohormone-free media. On the other hand, the potato hairy root calli could be cultured on the phytohormone-free media but not on media containing more than 40 ㎍/ml kanamycin. In these conditions, the viability of both protoplasts were above 90%, These selection markers were used for the selection of protoplasts fused between the two, i.e. protoplast fusion was detected using selection media containing 100㎍/ml kanamycin and with no phytohormone. The mixture of 1.0% cellulase, 0.3% macerozyme, and 0.7M mannitol was best for the maximum protoplast production for tobacco, and that of 2.0% cellulase, 2.0% macerozyme, 1.0% dricelase, and 0.5M mannitol for potato. Both tobacco mesophyll and potato callus protoplasts were fused by using PEG solution on the selectable medium. Cell walls were regenerated after 5 days in this medium, and colonies were alive until 4 weeks after cultural, but died after 6 weeks.

• 한국약용작물학회지
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• 제13권4호
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• pp.154-160
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• 2005

자연산 인진호와 조직 배양체의 유용 생리활성을 살펴 보았다. 우선, 항암 효과를 살펴보기 위하여 인간 폐암세포(A549)와 위암세포(AGS), 인간 간암세포(Hep3B)와 유방암 세포(MCF7) 4가지 암세포주를 이용하여 세포 생육 저해능을 측정하였다. MTT assay의 경우 1.0g/l 의 농도에서 캘러스가 A549와 ACS에 대해 각각 약 45%와 42%로 모상근과 기내배양에 비해 높은 세포 생육 저해능을 나타내었고, 자연산 인진호는 약 45%와 38%로 캘러스와 비슷한 항암 활성을 나타내었다. SRB assay의 경우도 캘러스가 가장 높은 항암 효과를 나타내었는데 대체적으로 약 55% 이상의 암세포 저해율을 나타내었으며, 자연산 인진호의 항암 활성에 비해서도 높은 수치를 나타내었다. 면역세포를 이용한 생육도와 cytokine의 분비량을 측정한 결과 B 세포의 생육도는 6일째까지 계속적인 증가를 가져왔고, 이에 따라 cytokine의 분비량 또한 $TNF-{\alpha}$와 IL-6 모두 6일째까지 증가하는 경향을 나타내었다. 면역세포의 생육도의 경우는 자연산 인진호가 가장 높은 생육도를 나타내었고, 인진호의 기내배양, 모상근, 캘러스 중에서는 모상근에서 가장 높은 생육도를 나타내었다. Ctyokine의 경우도 $TNF-{\alpha}$에서 자연산 인진호의 분비량이 가장 많았고, 배양 방법에 따른 인진호의 경우 캘러스가 가장 많은 분비량을 나타내었다. IL-6의 경우는 모든 sample에서 control에 비해 높은 분비량을 나타내었고, 자연산 인진호와 기내배양, 모상근, 캘러스와 비교했을 때 큰 차이를 나타내지 않았다. HPLC 분석을 통한 추출물의 물질 비교 분석 결과 기내배양과 모상근에서는 자연산 인진호에 비해 주요 성분 peak인 artemisidin 면적이 모두 낮은 경향을 나타내었고, 캘러스의 경우는 일반 인진호에 비해 peak의 면적이 비슷한 경향을 나타법으로서, 캘러스가 다른 조직 배양체보다 인진호의 주요 성분인 artemisidin 성분의 함량이 더 높은 것으로 나타나 캘러스가 기내배양이나 모상근 보다 높은 항암 효과를 나타낸 것으로 사료되어진다. 이와 같이 자연산 인진호와 조직 배양체의 항암 효과나 면역활성에서 큰 차이를 나타내지 않았기 때문에, 이러한 조직배양체가 자연산 인진호를 대체 할 수 있는 하나의 방법으로서 환경적인 측면과 자원 보존적인 측면에서 볼 때 가치있는 결과라고 사료된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제35권2호
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• pp.99-105
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• 1992

국화과의 일종인 개똥쑥(Artemisia annua L., 청호(靑蒿))에는 항말라리아 물질인 artemisinin이 함유되어 이 물질을 조직배양 방법으로 얻을 수 있는 가능성을 연구하였다. 먼저 식물조직의 유기를 위해 생장조절 물질을 조사한 결과 pcPA와 BAP, 그리고 pcPA와 2iP의 가장 적절하였다. 식물조직의 생장도 역시 pcPA와 BAP가 각각 $1.0\;{\mu}M$과 $0.5\;{\mu}M$일 때, 그리고 sucrose가 2%일 때 가장 우수하였다. MS배지를 제외한 다른 배지들은 성장을 뒷바침하지 못하였다. 다른 생장조건들은 기존의 배지 조성을 능가하지 못하였다. 개똥쑥은 Agrobacterium으로 형질 전환되어 crown gall과 hairy root를 생성하였다. 그러나 hairy root는 MS 배지에서 배양하였을 때 더 이상의 생장을 보이지 않고 crown gall만이 정상 식물 조직보다 더욱 빠른 성장을 보였다. 배양된 조직과 형질 전환된 tumor의 현탁배양액에서 arteannuic acid와 dihydroarteannuic acid가 흔히 보이는 식물 steroid와 함께 발견되었으나 artemisinin은 발견되지 않았다.

• 식물조직배양학회지
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• 제28권3호
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• pp.123-128
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• 2001

인삼 callus의 기내배양에 의해서 항암물질을 대량생산하기 위한 연구의 일환으로 인삼 우수계통으로부터 기내에서 callus를 유기하여 polyacetylene 고함유 세포주를 선발하고, 인삼 callus의 polyacetylene 생산에 미치는 식물호르몬 및 배지의 영향을 조사하였다. 식물호르몬 CPA가 첨가된 MS배지에서 유도된 인삼 우수계통 callus에서는 polyacetylene 중에서 panaxynol은 TLC와 GC에 의해서 전혀 검출할 수 없었으나, callus에 따라서는 panaxydol이 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히, 강력한 항암효과를 가지고 있는 panaxydol은 우수계통 callus 18종 중에서 5종이 형성하였으며, 30201계통 callus에서 가장 많이 검출되었다. 또한 인삼 10301계통 callus는 CPA가 단독으로 첨가된 배지에서 panaxydol을 생성하지 못하였으나, CPA 2 mg/L와 BA 0.05 mg/L 첨가구에서는 callus의 생장도 양호하였으며, panaxydol도 생성하였다. 인삼 callus의 생장과 panaxydol의 합성에는 MS배지보다 SH 배지가 더 양호하였으며, NAA와 sucrose는 전혀 영향을 미치지 않았다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권3호
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• pp.207-217
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• 1998

한국에서 자생한 자연산 tumor 조직과 근권토양으로부터 형질전환율이 높은 hypervirulent Agrobacterium spp를 분리하기 위해서 Salix, Diospyros, Populus 및 Malus에서 형성된 tumor 조직과 근권토양을 채취하괴 Schroth 선택배지와 New and Kerr 배지를 이용하여 78 균주의 colony를 특성에 따라 분리하였다. 이중에서 48 균주가 당근 disc에서 tumor를 형성하였으며 tumor를 형성한 균주중 형성시기가 빠르며 크기가 커 hypervirulent 균주로 생각되는 A. tumefaciens SP101을 biotype 1, 그리고 A. tumefaciens SM042를 biotype 2로 동정하였다. 토양중에서 선발한 A. tumefaciens SM042와 disarmed A. tumefaciens PC2760에 kanamycin 저항성 유전자를 함유하고 있는 binary vector pGA643을 도입하여 conjugant인 A. tumefaciens SM643과 A. tumefaciens PC643을 kanamycin과 tetracycline이 함유된 최소배지에서 획득하였다. 연초의 형질전환을 위해서 conjugant Agrobacterium과 연초조직을 동시배양 후 2,4-D와 kanamycin이 함유된 선발배지에 치상하여 형질전환을 유도한 결과 A. tumefaciens SM643이 A. tumefaciens PC643보다 더 많은 캘러스가 형성되었다. 그러나 A. tumefaciens PC643을 사용한 형질전환 캘러스는 대부분 friable한 캘러스로 유도되었으며 정상적으로 식물체로 생장하였으나 A. tumefaciens SM643을 사용한 캘러스는 매우 딱딱하며 둥그런 형태의 캘러스와 friable한 캘러스가 혼재한 상태로 생장하였으며, 이중에서 friable한 캘러스는 정상적인 shoot가 형성되었으나 딱딱한 캘러스로 유도된 형질전환체는 식물체로 형성되지 않고 반구형 미색의 전형적인 tumor 캘러스로 생장하였다. 한편 형질전환시 캘러스를 유도하지 않고 직접 shoot를 형성시킨 결과 disarmed Ti-plasmid를 사용하지 않고 wild-type Ti-plasmid를 사용해도 정상적인 형질전환체를 획득할 수 있었다.