Early gonadal development and sexual differentiation of dark-banded rockfish (Sebastes inermis Cuvier) were followed from parturition to 400 days post parturition (dpp). During this period, average total length (TL) increased from 0.57 to 13.18 cm. Primordial germ cells (PGCs) were first detected at 0.68 cm TL (10 dpp). When fish reached 1.52 cm TL (50 dpp), initial stages of ovarian differentiation were identified by the presence of PGCs containing condensed chromatin and their transformation into meiotic oocytes. At 10.23 cm TL (300 dpp), the ovaries gradually developed into oocytes in the primary yolk stages. Ovary growth was rapid after sex differentiation, but testis tissue continued to multiply without growing until fish reached 6.97 cm TL (200 dpp), after which the production of spermatocytes, spermatogonia, and cyst cells was apparent. Histological analysis of gonadal structure suggested a gonochoristic sexual development pathway. Our analysis of the sex ratio at 400 dpp showed a significantly higher proportion of males.
유도된 3배체 미꾸라지 Misgurnus mizolepis의 자, 치어를 재료로 시원생식세포의 출현, 생식 융기 및 원시생식소 형성 및 발달 과정을 조사하여 2배체와 비교하였다. 2배체와 3배체 모두 시원생식세포는 부화후 2일, 체후부의 중신관과 장관사이의 섬유성 간충직을 따라 식별되었다. 생식 융기는 부화후 4-5일 체벽 상피로부터 복강으로 돌출되기 시작하였고 원시 생식소는 부화후 8일의 후기자어에서 식별되어, 부화후 20-25일까지 시원생식세포들의 분열 증식과 풍부한 섬유성 결체조직의 형성과 함께 앞쪽으로 신장되어 가는 선상의 생식소로 나타나 두 실험군 모두 동일한 조직학적 특성을 보였다. 시원생식세포의 형태는 2배체와 3배체 모두 원반형에서 타원형 내지 구형으로 발달되었고 크기의 차는 없었으나, 원시생식소의 길이는 2배체가 3배체에 비해 길게 나타났다.
본 연구는 원시생식기 유래 원시생식세포를 이용하여 효율적인 생식선 카이메라 생산 조건을 확립하고자 하였다 전체 실험구에서 301마리가 부화하였으며, 이중 수컷 141마리, 암컷 160마리가 성성숙에 도달하였다. 후대 검정을 통하여 수컷 15마리와 암컷 12마리가 생식선 카이메라로 밝혀졌으며, 생식선 카이메라 생산 효율은 평균 9.0%였다. 실험처리구간 생식선 카이메라 생산효율간에 유의적인 차이는 없었으나 (p=0.6831), 생식선 카이메라의 공여체 유래 자손 생산 효율은 유의적인 차이를 나타냈다. 실험처리구간 생식선 카이메라의 공여체 유래 자손 생산효율은 피콜처리 없이 10일간 배양한 원시생식세포를 이식하였을 때 가장 높았고 (49.7%), 피콜처리후 배양하지 않은 원시생식세포를 이식하였을 때 가장 낮았다 (0.6%). 또한, 피콜 처리에 상관없이 10일간 배양한 원시생식세포를 이식한 실험구가 배양하지 않은 실험구와 5일간 배양한 실험구보다 각각 50배와 10배 더 높은 전이효율을 나타내었다 (p<0.0001). 따라서, 수용체 배자에 이식하기전에 실시한 체외배양 기간은 효율적인 생식선 카이메라 생산에 있어서 매우 중요한 요인으로 사료된다. 이와 같이, 본 연구에서는 배양 기간, 피콜 처리 유무 등에 대한 비교 분석을 통하여 생식선 카이메라 생산을 위한 최적 조건을 확립하였다.
본 연구는 북방전복의 생식생물학적 정보를 제공하고 아울러 성의 인위적인 조절에 필요한 정보를 제공하기 위하여 수행하였다. 북방전복의 형태학적 성분화 과정은 크게 다음과 같이 5단계로 구분할 수 있었다. 1) 생식소 외막 형성 (FGOM) (${\leq}SL\;10.0{\pm}1.0mm$), 2) 장과 간췌장 사이의 결체조직에 시원생식세포 (PGCs: primordial germ cells) 출현 (PAC) 및 생식소 내강 형성 (FGC) (SL $15.0{\pm}2.0mm$), 3) 생식소 내강 상피층에 PGCs 출현 (PAG) (SL $18.0{\pm}2.0mm$), 4) 생식세포형성소낭 형성, 초기 난모세포 및 정원세포 출현 (FGOC) (SL $21.0{\pm}2.0mm$), 5) 형태학적 성분화 (MSD) (${\geq}SL\;23.0{\pm}2.0mm$). 조직학적 분석 결과, 각장 24.1-25.0 mm 그룹에서 북방전복의 성분화율은 90.0%였으며, 성비 (암:수)는 1:0.8로 나타났다.
동결 닭 원시생식세포의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화하기 위해서는, 닭 원시생식세포의 동결보존기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존세포를 확보하는 것이 반드시 필요하다. 닭 원시생식세포는 배양 5.5일령의 닭 원시생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 원시생식세포를 분리했다. 15% 각각의 EG를 동결보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 10% EG 처리군에서 85.63%로 동일한 농도의 PG 처리군(66.81%)보다 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 생존율을 보였다. 한편, 상업용 닭(한협3호)에서도 오계와 비슷한 경향의 결과를 확인하였다. 이상의 결과들로부터 유리화 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 최적의 동결 보호제로서 사용 가능함을 확인하였다.
동결 닭 PGCs의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화 하기 위해서는, 닭 PGCs의 동결 보존 기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존 세포를 확보하는 것과, 생식계열 키메라의 제작 효율을 높이는 것이 반드시 필요하다. 닭 PGCs는 배양 5.5~6일령의 닭 원시 생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 PGCs를 분리했다. 15% 각각의 EG와 DMSO를 동결 보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 10% EG+FBS 조합의 처리군에서 상업용 닭인 한협육종협회3호종(B : 88.7%)이 오계종(A : 85.1%), 아사 브라운종(C : 84.6%) 그리고 화이트 레그혼종(D : 85.9%)의 세 품종보다 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 확인하였다. 간이 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 10% DMSO와 함께 최적의 동결 보호제로서 사용 가능성을 확인하였다.
동결 닭 원시 생식 세포의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화 하기 위해서는, 닭 원시 생식 세포의 동결 보존 기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존세포를 확보하는 것이 반드시 필요하다. 닭 원시 생식 세포는 배양 5.5일령의 닭 원시 생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 원시 생식 세포를 분리했다. 15% 각각의 EG를 동결 보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 동결 보호제로 10% EG를 이용한 유리화 처리군에서 85.63%로 동일한 농도의 PG 처리군(66.81%)보다 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 생존율을 보였다. 한편, 10% EG를 이용한 완만 동결 처리군에서 66.14%로 동일한 농도의 PG 처리군(50.11%)보다 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 생존율을 보였다. 이상의 결과들로부터 유리화 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 최적의 동결 보호제로서 사용 가능함을 확인하였고, 이는 한국재래닭(오계)의 원시 생식 세포의 동결 보존의 실용화가 보다 더 향상될 수 있는 또 하나의 방법이 될 수 있음을 시사한다.
배자 생식세포 발달에 관련된 메카니즘을 밝혀내기 위해서, 닭 배자 생식기에서 추출한 원시 생식세포의 단백질체 지도를 만들었다. 총 500 배자를 6일간 배양하여 배자 생식기를 획득했고, 7-10일 배양 후, 배양된 원시생식세포는 2차원 젤 전기 영동법에 의해 분할되어 졌다. 유의적 발현 수준을 나타낸 많은 단백질 스팟 들은 MALDI-TOP 와 LC-MS/MS에 의해 확인되었으며, 89개의 단백질 스팟 중에 50개의 mass spectra 들이 데이터베이스에서 조류 단백질과 일치함을 확인하였다. 본 실험에서 행한 단백질체 지도는 형질전환 연구와 생식세포 생물학 분야에 중요한 참고 문헌으로 가치를 가질수 있을 것이다.
조류의 경우에는 포유류와 달리 수정란의 성별이 암컷에 의하여 결정된다. 수컷은 동일접합체로 ZZ 염색체를, 암컷의 경우에는 이형접합체로 Z W 염색체를 갖기 때문이다. 현재까지 조류에 있어서 염색체 분석 등에 의한 암 ·수의 세포 유전학적인 특성은 많은 연구가 되어 있으나, 배발달 초기의 원시생식세포 등에 대해서는 많은 연구가 진행되어 있지 않다. 따라서 본 연구는 암컷의 원시생식세포를 분리하여 숫컷의 초기 배자에 주입함으로써 수용체 배자의 원시생식기내로 이동이 가능한지를 검증하였으며, 또한 수컷의 원시생식기내로의 이동 후 정상적으로 분열 및 분화가 가능한지를 초기 배발달 과정에서 확인하였다. 본 연구 결과, 암컷의 원시생식세포는 수컷의 수용체 배자에 재주입시 정상적인 원시생식기내로의 이동 능력을 보여주었으며, 분열 ·분화함을 알 수있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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