Trypsin like protease (TLP) and metalloprotease (MTP) were induced in associated with the mycelium differentiation in Streptomyces albidoflavus SMF301. TLP and MTP were purified and characterized from the culture. The molecular mass of TLP and MTP were estimated to be 32 kDa and 18 kDa, respectively. The molecular mass of TLP and MTP were estimated to be 32 kDa and 18 kDa, respectively. The optimum pH and temperature of TLP were 10 and 40.$^{\circ}C$ Those of MTP were 8 and 55 $^{\circ}C$ TLP was stable at alkaline pH (6-9) and unstable above 45.$^{\circ}C$and MTP was stable at alkaline pH and unstable above 80.$^{\circ}C$ Km and Vmax values with benzoyl-arginyl p-nitroanilide of TLP were 139 $\mu$M, and 10 nmole of nitroanilide released per min per$\mu\textrm{g}$ protein, respectively. Km, and Vmax values with a synthetic substrate, leucine p-nitroanilide, or MTP were 58.9 $\mu$M, 3.47 nmol of nitroanilide released per min per$\mu\textrm{g}$protein, respectively. TLP was inhibited competitively by leupeptin; the inhibition constant was 0.0031 $\mu$M. MTP was inhibited by EDTA, phenonthroline and bestatin.
$\beta-Galactosidase$ is an enzyme which catalizes hydrolysis of lactose, a natural substrate, to glucose and galctose and transferring some monosac-charide units to active acceptors as sugar or alcohol. The occurence of $\beta-Galactosidase$ is known in various microorganisms, animals and higher plants and has been studied by many investigatigators. Especially, a great deal of articles for the enzyme of E. coli have been presented in genetic control mechanism and induction-repression effects of proteins, On the other hand, in the dairly products industry, it is important to hydrolyes lactosd which is the principal sugar of milk and milk products. During the last few years, the interest in enzymatic hydrolysis of milk lactose has teen increased, because of the lactose intolerence in large groups of the population. Microbial $\beta-Galactosidases$ are considered potentially most suitable for processing milk to hydrolyse lactose and, in recent years, the immobilized enzyme from yeast has been examined. Howev, most of the microbial $\beta-Gal$ actosidase are intracellular enzymes, except a few fungal $\beta-Gala-$ ctosidases, and extracellular $\beta-Galactosidase$ which may be favorable to industrial applieation is not so well investigated. On this studies, a mold producing a potent extracellular $\beta-Galactosidase$ was isolated from soil and identified as an imperfect fungus, Beauveria bassians. In this strain, both extracellular and intracellular $\beta-Galactosidases$ were produced simultaneously and a great increase of the extracellular production was acheved by improving the cultural conditions. The extracellular enzyme was purified more than 1, 000 times by procedures including Phosphocellulose and Sephadex G-200 chromatographies. Several characteristics of the enzymewas clarified with this preparation. The enzyme has a main subunit of molecular weight of 80, 000 which makes an active aggregate. And at neutral pH range, it has optimum pH for activity and stability. The Km value was determined to be 0.45$\times$10$^{-3}$ M for $o-Nitrophenyl-\beta-Galactoside.$ In any event, it is interesting to sttudy the $\beta-Galactosidase$ of B. bassiana for the mechanism of secretion and conformational structure of enzyme.
토양으로부터 갈락토스 전이활성이 우수한 ${\beta}-galactosidase$를 생산하는 미생물을 분리하고 부분동정하여 Bacillus sp. A1으로 명명하였다. 선발된 균주가 생산하는 효소는 40%(W/W) 유당용액에서 초기유당의 70%가 전환되었을 때 90%의 높은 전이율을 보였다. 효소의 생합성은 유당에 의하여 유도되었고 포도당에 의하여 저해받았다. 효소생산을 위한 탄소원으로는 유당이, 유기질소원으로는 효소분해 대두단백질이 적합하였다. 탄소원과 유기질소원을 최적화하므로써 배양된 균주의 효소활성은 최소배지에서 배양된 효소활성과 비교하여 약 3배 이상($0.5\;U/m{\ell}-broth$에서 $1.8\;U/m{\ell}-broth$로) 증가하였다.
제주도 밀감 과수원의 토양으로부터 polygalacturonase 고생산 효모를 분리하였다. 분리된 strain CS-2 의 생리화학적인 실험을 수행한 결과 분리균주는 Diazonium bule B color test 와 urease test에서 양성반응, acetic acid, citrate acid 생성 시험, gelatin 분해시험, fat 분해시험에서는 음성반응을 나타났고, 탄소원의 조사에서 galactose를 탄소원으로 이용할 수 없었고, 질소원은 모두 이용할 수 없었다. 또한 $30^{\circ}C$ 에서는 성장하는 반면, $35^{\circ}C$ 이상에서는 성장을 하지 못하였고 50% 이상의 glucose 농도, 0.01% cyclohexamide 그리고 1% acetic acid에서 성장을 하지 못하였다. 현미경을 이용한 형태학적 관찰 결과, 크기는 $1.3{\times}2.9$$\mu$m인 타원형으로 관찰되었다, ,multiple budding을 하며 ascospore는 존재하는 반면 pseudomycelium과 true mycelium 은 존재하지 않았다. 이와 같은 결과를 종합하여 Cryptococcus 속의 특징과 유사함을 알 수 있었다. 분리된 Cryptococcus sp. CS-2 의 polygalacturonase 는 유도적으로 합성되어 catabolic repression 에 의해 조절됨을 알 수 있었으며, 3일 배양시 가장 높은 활성도를 나타내었으며, 고유 활성도는 2.50~2.55 units/mg 으로 나타났다. 이러한 polygalacturonase를 SDS-PAGE, activity staining 그리고 단일 탄소원에 따른 단백질 양상의 변화를 비교하여 분자량 측정한 결과 약 46KDa으로 나타났다.
내열성 {\alpha}$-amulase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 각종 분리원으로 시료를 채취하여 55$^{\circ}C$ 이상에서 생육하고 가장 내열성 {\alpha}$-amulase 생산능이 우수한 균주를 분리, 동정한 결과 thermophilic Bacilus 속으로 추정되었다. 균체생육과 효소생산의 최적온도는 60~$65^{\circ}C$였고, 초발 pH8.0에서 가장 높은 효소생산능을 보였다. {\alpha}$-amulase 생산에 가장 양호한 탄소원은 soluble starch, dextrin, prtato starch, corn starch 등의 다당류이었으며 glucose, fructose 등의 단당류에서는 효소생산이 미약하거나 억제를 받았다. {\alpha}$-amulase 생산에 가장 중요한 질소원은 yeast extract이었따. 0.1% $CaCl_2{\cdot}2H_2O$, 0.001%의 Tween-80의 첨가는 {\alpha}$-amulase 생산성을 증가시켰다. 본 공사균이 생산한 조효소액의 특성을 검토해 본 결과, 8$0^{\circ}C$에서 최적 효소활성을 보였으며, 10$0^{\circ}C$에서도 23%의 잔존활성을 나타내었다. 최적 pH는 5.0이었다. $Ca^{2+}$은 효소활성 증진에는 영향을 미치지 않았다. 공시균으로부터 분리한 genomic DNA를 중온성 BAcillus subtilis KCTC 1024에 형질전환시킨 결과, transformant는 wild type에 비하여 약 2배의 효소활성이 증가되었다.
xylA 유전자의 프로모터상에서 조절양상을 조사하기 위하여 xylA 유전자의 프로모터(Pxyl)와 lacZ 유전자를 연결한 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 제작하여 xylose에 의한 ${\beta}-galactosidase$ 생산의 조절양식을 조사하였다. xylA 프로모터 부위를 분리하여 lac 프로모터가 없는 고복제수의 lac 오페론 백터인 pMC1403에 클로닝시켜 pMCX191을 제작하여 reading frame에 변화가 없는 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 만들었으며 이 벡터에서 Pxyl-lacZ 단편을 분리한 후 저복제수 벡터인 pLG339에 클로닝시켜 pLGX191을 제작하였다. 상기 플라스미드들을 xylA 변이주인 DH77에 형질전환시켜 Pxyl-lacZ 융합 유전자에서 ${\beta}-galactosidase$의 발현조절을 조사한 결과 xylose 농도에 따른 유도, glucose에 의한 발현억제 및 cAMP에 의한 억제해제 양상 등이 염색체상의xylA 유전자의 발현조절과 같은 경향을 나타내었다. pMCX191과 pLGX191을 이용하여 유전자 투여 량 효과를 본 결과도 복제수에 따른 차이가 크지 않았다. xylA 프로모터 부위내 조절영역를 추정하기 위해 구조유전자 상류 -209 bp를 포함한 xylA 유전자를 pUC19에 클로닝시킨 pUX30에서 프로모터 부위가 부분결손된 벡터들을 제작하여 결손부위의 염기서열을 확인하였다. 이들 부분결손 xylA 프로모터를 가진 xylA 유전자에서 xylose isomerase의 발현을 조사한 결과, 번역 개시점에서 -166 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX31과 pUX32의 경우pUX30과 비슷한 발현 양상을 보인 반면 -120 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX33과 pUX34에서는 모벡터에 비해 약 30% 수준의 발현을 보였다. 또한 pUX33과 pUX34에서는 xylose 유도시 cAMP에 의한 발현 촉진효과도 볼 수 없었다. -59 bp 이상의 부위가 결손된 pUX35의 경우에는 전혀 xylA 유전자의 발현이 일어나지 않았다. 이러한 결과로 볼때 xylA 프로모터내의 조절부위는 -165 bp에서 -59 bp 사이에 존재하는 것으로 추정되었다.
예로부터 옷감의 염료 및 식용색소로 사용되어 온 치자는 혈당 저하, 항 종양, 항 혈전, 혈관신생 억제, 항산화, 항균 등 다양한 생리활성이 있는 것으로 보고되고 있으나 치자의 아질산염 소거 작용이나 육제품에의 이용에 관한 연구는 미비하다. 본 연구에서는 치자의 아질산염 대체 효과와 항균활성 등 기능성을 살펴보아 치자의 다양한 생리 기능성이 부여된 건강 지향적 육제품 개발의 기초자료로 활용하고자 아질산염(50, 100, 150 ppm)과 치자 추출물(0, 0.25, 0.5%)의 첨가량에 따른 돈육 패티의 물리 화학적 품질특성을 평가하고 아질산염 잔류량과 저장성을 살펴보았다. 패티의 색도를 측정한 결과 치자 추출물의 첨가에 따라 명도(CIE $L^*$)와 적색도(CIE $a^*$)가 감소되는 반면 황색도(CIE $b^*$)가 증가하였다. 돈육 패티를 가열한 결과 치자추출물이 첨가되지 않은 control 군에서는 아질산 첨가량이 많을수록 가열감량이 작았으나, 치자 추출물 첨가에 의한 가열감량의 변화는 명확히 관찰되지 않았다. $4^{\circ}C$에서 6주간 저장 후 패티의 pH, TBARS 및 VBN을 살펴본 결과 치자 추출물 첨가량이 많을수록 pH가 낮은 경향이었으나, TBARS와 VBN은 변화가 없었다. 돈육 패티의 아질산염 잔류량은 저장기간이 길어짐에 따라 점차 감소하였으며, 치자 추출물 첨가량이 많을수록 잔류량이 낮았다. 저장 중 미생물 오염을 살펴본 결과 대장균은 검출되지 않았으며, 일반세균은 치자 추출물 첨가에 따라 감소하여 항균 작용을 위한 아질산염 사용의 대체효과를 보였다. 이상의 결과를 보면 돈육 패티 제조 시 치자 추출물의 첨가는 아질산염 잔류량을 감소시킴과 함께 저장시 항균성을 증가시켜 건강 향상 기능성 천연 소재로서 치자의 이용 가능성을 시사한다.
Astaxanthin의 산업적인 생합성을 위하여 wild type인 P.rhodozyma B30 효모를 UV, NTG 등으로 돌연변이 처리하여 0.5 mM $\beta$-ionone이 포함된 선별배지에서 carotenoids 합성능력이 우수한 변이주 B76을 분리하였다. 변이주 B76은 wild type과 비교시 균체 생성능력은 큰 차이가 없었으나 carot-enoids 합성능력은 40% 이상, astaxanthin 합성능력은 50% 이상 향상되었다. 선별된 변이주 B76의 최적 발효배지 및 배양 조건 선정을 위한 플라스크 배양실험 결과 최적 탄소원으로 glucoserk, 최적 질소원은 CSL : (NH4)2SO4 : yeast extract = 6 : 2 : 0.1이 혼합된 배지가 선정되었다. C/N ratio는 1.7~2.0 범위에서 유사한 발효성능을 보았으며(산업적인 생산성을 고려하여 2.0을 최적으로 선정), 배양온도는 $22^{\circ}C$가 최적이었다. 초기 pH는 가장 높은 세포농도를 나타낸 6.0을 최적으로 하였다. 종균 접종량은 전반적으로 균체량과 carotenoids 합성능력에는 영향을 미치지 않았으며 산업적인 생산성을 고려하여 3%(v/v) 수준이 적절한 것으로 사료되었다. 이와 같이 플라스크 배양을 통해 확립된 최적 배지 및 배양조건을 기초로 5 L 발효조를 이용한 회분식 배양실험을 통해 탄소원의 최적 농도는 18%임을 확인하였다. 특히 B76 변이주는 22%(w/v)까지의 고농도 glucose 존재하에서는 catabolite rep-ression을 받지 않는 것으로 나타났다. 용존산소가 부족한 경우에는 균체성장 및 색소합성이 저해되었고, 따라서 통기속도 1.0 v/v/m, 교반속도 400 rpm 이상을 유지함이 필요하였다. B76 세포는 배양 3일차에 exponential phase에 진입한 후(최대 Yx/s = 0.37) 배양 4일차에 stationary phase에 도달하였다. Carotenoids 및 astaxanthin 생합성은 세포성장이 정지한 후인 배양 5일차에 급격하게 증가하는(최대 Yp/s = 1.08) 전형적인 mixed-growth-associated 형태를 나타냈다. 이는 exp-onential phase 동안 급격한 균체성장으로 용존산소가 부족하여 NADH balance에 의해 astaxanthin 생합성 경로 중 탈수소화 단계가 저해되기 때문으로 사료되었다. 최종 세포농도는 43.3 g/L, 단위부피당 carotenoids 함량은 149.4 mg/L, astaxanthin 함량은 110.6 mg/L로서 산업적인 생산성이 있는 것으로 나타났다. 이번 연구를 통하여 개발된 변이주 B76 및 이의 대량 발효를 위한 최종조건의 정립은 향후 astaxanthin의 산업적 생산공정에 필요한 기초자료로 이용될 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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