• 한국수정란이식학회지
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• 제16권3호
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• pp.203-211
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• 2001

성간별에 이용할 돼지 수정란을 체외수정 방법으로 생산하기 위하여 돼지 난소에서 채취한 난자를 NCSU 23 배지에서 eCG, hCG를 첨가한 상태에서 22시간, 첨가하지 않은 상태에서 22시간 체외성숙을 시킨 후 mTBM을 이용하여 여러가지 정자농도(5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 그리고 10.0$\times$$10^{5}$ )에 따라 6시간 수정시켰고, NCSU 23 배지에서 배양시켰다. 배양 후 44시간에 수정란의 분할률을 관찰하였고, 144시간에 배반포 형성율을 확인하였다. 성감별 방법은 체외수정으로 생산된 배반포를 돼지 Y-specific DNA primer를 이용하여 PCR 처리를 한 후 전기영동으로 491 bp에서 증폭된 band의 유무에 따라 암컷과 수컷의 성을 판정하였다. 1. 돼지 체외수정에서 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 및 10.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 수정란 분할률은 각각 55.95, 67.88, 60.18, 47,60%이었다. 2. 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 배반포 형성율은 각각 16.03, 22.40, 21.41, 12.37%이었다. 3. 31개의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 PCR을 이용한 성감별 결과는 18개가 수컷, 13개가 암컷으로서 각각 58.1%과 41.9%를 나타내었다. 이상의 결과로 보아 돼지의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 성감별시 PCR 기법이 신속하고 정확하게 성감별을 실시할 수 있는 방법으로 판단되었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.169-174
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• 2005

본 연구는 배양액의 종류에 따른 돼지 난자의 성숙 및 단위발생란의 배반포 형성율을 검토하였으며, 배양액의 삼투압과 발달 시기에 따른 배양액의 삼투압 변화가 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 검토하였다. 실험 1에서 난포란을 NCSU-23 mWM 및 mKRB에 각각 성숙배양한 결과 성숙률은 $62.1\~71.3\%$로 배양액에 따른 차이가 없었다. 실험 2에서는 각각의 배양액으로 성숙된 난자를 활성화 처리 후 동일한 배양액으로 6일간 배양하여 발달율을 검토한 결과, 배반포 발육율은 NCSU-23에 배양 시 $22.9\%$로 타 그룹($0\~0.6\%$)보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 실험 3에서는 단위발생란을 NaCl 안에 의해 256, 280 및 300 mOsmol(mOsm)로 조정한 NCSU-23에 6일간 배양한 결과, 배반포 발육율은 $11.0\~14.4\%$로 실험군 간에 유의적인 차이는 없었으나 삼투압이 낮을수록 난자의 fragment 비율이 높게 나타났다(P<0.05). 실험 4에서는 단위발생란을 삼투압이 조정된 세 종류의 NCSU-23에 48시간 배양한 후 삼투압이 높거나 낮은 NCSU-23으로 옮겨 4일간 추가 배양한 결과 배반포 형성율은 배양 48시간 후에 배양액의 삼투압을 낮춰 주었을 때($21.0\%$)가 높여 주었을 때 ($11.8\%$) 보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).본 실험의 결과는 돼지 단위발생란의 발육이 배양액의 종류 및 삼투압에 의해 영향을 받으며, 배양액의 삼투압은 돼지 단위발생란의 발육 단계별로 영향을 주어, 초기에는 높은 삼투압의 배양액에서 배양하고 일정 시간 후 낮은 삼투압의 배양액으로 배양함으로써 발육이 증진될 수 있음을 시사한다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제8권
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• pp.45-50
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• 1990

본 실험은 성선(性腺)자극호르몬과 우태아혈청(牛胎兒血淸) 첨가가 돼지 난포란(卵胞卵)의 체외성숙(體外成熟) 및 체외수정(體外受精)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 미경산돈(未經産豚)(체중 80~90kg)의 난소(卵巢)를 도살된 직후에 절취하여 $37{\sim}39^{\circ}C$의 보온병에 담아 실험실로 운반하여 난포(卵胞)직경이 3~5mm되는 것만을 골라 난포(卵胞)를 찔러서 난포란(卵胞卵)을 채취하였다. 성숙모돈(成熟牡豚)(체중 130~150kg)의 정소상체미부정자(精巢上體尾部精子)를 $4{\times}10^8cells/m{\ell}$ 농도로 희석하여 체외수정(體外受精)에 이용하였다. 본 실험의 경과를 요약하면 다음과 같다. 1. m-KRB와 10% FCS를 m-KRB에 첨가한 경우 성숙율(成熟率)은 82.37%이며, 10% FCS가 첨가된 배양액에 PMSG, hCG 그리고 PMSG와 hCG를 각각 $10IU/m{\ell}$ 첨가한 경우 66, 58, 68%로서 성숙율(成熟率)이 향상되었다. 2. 난구세포(卵丘細胞)의 팽화(膨化)는 m-KRB와 10% FCS가 첨가된 배양액에서 일어나지 않았으나 10% FCS가 첨가된 배양액에 PMSG, hCG 그리고 PMSG와 hCG를 각각 $10IU/m{\ell}$ 첨가시 92, 13, 91%로서 팽화율(膨化率)이 향상되었다. 3. m-KRB에서 성숙된 난포란(卵胞卵)의 체외수정(體外受精)에서 정자침입율과 웅성전핵(雄性前核) 형성율은 각각 93.7%였으나 FCS와 성선(性腺)자극호르몬을 첨가한 경우 각각 100, 80%로서 웅성전핵(雄性前核) 형성율이 향상되었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권1호
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• pp.1-7
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• 2007

본 연구는 체외 성숙된 난자와 동결 융해 정자를 이용한 돼지의 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 정자 침투율, 웅성전핵 형성률 그리고 후기배로의 체외 발육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epidermal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간 배양하여 체외 성숙을 유도하였다. 성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결 융해정액을 이용하여 5mM caffeine과 10mM calcium chloride를 함유한 mTBM배양액에서 8시간 체외 수정하였다. 체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵 형성률을 조사하였고(실험 $1{\sim}3$) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3). 실험 1에서는 정자 농도를 $7.5{\times}10^5/ml$로 조정하여 나화 난자와 난구 세포 부착난자에서 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 $5{\times}10^6/ml$의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 $7.5{\times}10^5/ml$의 정자 농도로 체외 수정한 후 후기배로의 발육률을 조사하였다. 실험 1의 결과 정자 침투율은 나화 난자에 비해 난구 세포 부착 난자에서 유의적으로 감소되었다(35.2% vs. 77.4%; p<0.01). 실험 2에서 다양한 정자 농도에 의한 정자 침투율과 정상 수정률을 바탕으로 판단했을 때 $4.6{\times}10^6/ml$의 정자 농도가 다른 정자 농도에 비해 난구 세포부착 난자의 체외 수정에 적합한 것으로 나타났다. 체외 수정과정에서 난구 세포 부착된 상태로 수정된 난자는 나화 난자에 비해 유의적으로(p<0.05) 높은 분할률(48.8% vs. 58.9%), 배반포 형성률(11.0% vs. 22.8%)과 배반포 세포수$(22{\pm}2\;vs.\;29{\pm}2)$를 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 돼지의 체외 수정과정에서 난구 세포의 존재는 정자 침투를 저해하지만 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제13권4호
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• pp.329-339
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• 2009

Cortisol은 난소내 다량으로 존재하며, 난소 세포에 그 수용체가 있는 것으로 보고되고 있다. 또한 사람의 과립 및 황체화 세포에서 cortisol은 스테로이드 생성과 세포 대사에 영향을 미치는 것으로 알려지고 있으나, 배란 후 난포액에 높은 농도로 존재하는 cortisol이 과립-황체화 세포에 어떤 영향을 미치는 지는 정확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 실험에서 과배란 유도후 획득한 사람 과립-황체화 세포를 배양하면서 5, 50, $500{\mu}g/m\ell$ cortisol과 1 IU/$m\ell$ FSH를 처리하고 세포의 세포자연사와 분비된 progesterone$(P_4)$과 estradiol$(E_2)$량의 변화를 조사하였다. DNA 분절화 분석과 TUNEL 방법으로 세포자연사를 평가한 결과, cortisol는 농도 의존적으로 과립-황체화 세포의 세포자연사를 증가시켰고, 특히 50과 $500{\mu}g/m\ell$ cortisol을 처리한 군에서 유의한 차이를 보이며 세포자연사 비율을 증가시켰다. 또한 cortisol에 의한 세포자연사의 증가는 FSH에 의해 억제되지 못함을 알 수 있었다. 화학발광면역 측정법을 이용하여 배양내 $P_4$와 $E_2$의 양을 측정한 결과, cortisol을 처리한 후 $E_2$의 양은 변화가 없었던 반면 $P_4$의 양은 감소하였다. 이러한 cortisol의 $P_4$ 합성 억제 효과는 세포자연사 결과와 마찬가지로 FSH에 의해 회복되지 못함을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 일정 농도 이상의 cortisol은 과립-황체화 세포의 세포자연사를 유발시킬 수 있으며, 또한 $P_4$의 합성을 억제시킴으로써 난포 폐쇄를 직접적으로 유발시킬 수 있음 보여준다. 그러나 본 연구 결과들은 기존의 연구 결과와 상반된 결과를 보이고 있으며, 앞으로 과립-황체화 세포에 대한 cortisol의 생리적인 관련성을 밝혀 그 기전을 명확히 할 필요성이 있다.

• 대한수의학회지
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• 제37권1호
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• pp.71-78
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• 1997

This study was designed to investigate the number of the growing and mature follicles following gonadotrophin treatments for superovulation in mature rats. Eighteen mature rats (Sprague-Duwely, initially 190~230gm) were randomly alloted into 3 groups. One group was control group, another FSH-treated group was injected intramuscularly with 0.5 units of follicular stimulating hormone (FSH) / rat, and third PMS and HCG-treated group was intramuscularly injected with 20~25IU of pregnant mare serum (PMS) / rat and then at the 48 hrs later, with 20~25IU of human chorionic gonadotrophin (HCG) / rat. The uteri and ovaries of rats were collected and then were observed grossly and serial sections of paraffin embedding ovaries were stained with H-E. Number of ovarian follicles by following 3 grades of large, middle and small follicles from secondary and tertiary follicles were investigated by LM photography of preparations. Small follicles were classified as secondary follicles of preantral follicles with more than 2 layers of granulosa cells surrounding the oocyte and middle follicles were classified as secondary follicles with early signs of antral cavity or with more than one small cavity on either side of the oocytes and large follicles were classified as tertiary follicles with a single medium sized antral cavity or large well-formed antral cavity. In gross findings, the uteri were slightly swelling in FSH-treated group and markedly swelling or filled with fluid in the uterine lumen in PMS and HCG-treated group. In histological findings, the shape and size of the follicles were diverse in middle and large follicles of FSH-treated group and PMS and HCG-treated group, and proportion of atretic follicles was increased in FSH-treated group and PMS and HCG-treated group than those in control group. The uteri of FSH-treated group and PMS and HCG-treated group were hypertropied or filled with fluid in the lumens and walls of uteri. The wall tissue layers were flattened and their blood and lymph vessels were dilated. The mean number of follicle per ovary in control group were appeared to be $17.1{\pm}5.6$($14.0%{\pm}4.6%$), $37.8{\pm}9.1$($30.9{\pm}7.4%$) and $67.6{\pm}30.1$($55.2{\pm}24.6%$) respectively at large, middle and small follicles and total number of these 3 grade follicles were appeared to be $122.5{\pm}40.0$. The mean number of follicle per ovary in FSH-treated group were appeared to be $22.8{\pm}7.0$($17.4%{\pm}5.3%$), $43.4{\pm}6.6$($33.2{\pm}5.1%$) and $64.5{\pm}13.0$($49.3{\pm}9.9%$) respectively at large, middle and small follicles and total number of these 3 grade follicles were appeared to be $130.7{\pm}16.6$. The mean number of follicle per ovary in PMS and HCG-treated group were appeared to be $29.7{\pm}11.0$($16.3%{\pm}6.0%$), $61.9{\pm}17.2$($33.9{\pm}9.4%$) and $91.1{\pm}28.2$($49.9{\pm}15.4%$) respectively at large, middle and small follicles and total number of these 3 grade follicles were appeared to be $182.6{\pm}32.7$. The above findings reveal that large follicles were increased 29.8% in FSH-treated group and 73.7% in PMS and HCG-treated group than those in control group and in histologic findings, proportion of atretic follicles were more increased in ovaries with more number of more developing follicles.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제24권3호
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• pp.311-318
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• 1997

Bypassing acrosome reaction and fusion process in intracytoplasmic sperm injection(ICSI), most of injected spermatozoa still contain intact acrosome contents and plasma membrane. It Is not known yet what acrosome contents and plasma membrane of spermatozoa have effect on the development of embryo. For further understanding of fertilization process after ICSI, we studied the time of pronucleus formation, disappearance and first cleavage in human zygote, and pregnancy rate in relation to acrosome reaction rate of spermatozoa after ICSI. Seventy cycles undergoing ICSI program were randomly selected. Sperm suspension from 38 cycles were treated 50% human follicular fluid(hFF) for 3 hours in order to induce acrosome reaction, others were not treated as control. Acrosome reaction in hFF treated and non-treated group was assessed by fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated Arachis hypogea(PNA) and Pisum sativum agglutinin(PSA). Oocytes were classified into 'good' and 'poor' according to their morphology. After ICSI, fertilization of oocytes were assessed by detection of two pronuclei at 16 hours. The pronuclei disappearance and first cleavage of zygotes were observed at 24 hours, and then embryos were transferred to uterus after culture for 72 hours. The rate of acrosome reaction of spermatozoa in hFF treated group was significantly higher than that in control(p<0.01). Fertilization rates of good oocytes were not different both control and hFF treated group(81.3%(174/206) vs. 72.1%(102/130)). But, in poor oocytes, the fertilization rates in hFF treated group(72.1%(149/183)) were increased compared than those of control group (63.6%(98/140), p<0.01). In either good or poor oocytes, the rates of pronuclei disappearance in hFF treated-spermatozoa injected oocytes were higher than control (59.1%(103/174), 56.4%(84/149) vs. 32.4%(33/102), 37.8%(37/98), p<0.01). Also, the rates of thirst cleavage were increased in hFF treated group (31%(54/174), 24.1%(36/149)) compared than those of control group (10.8%(11/102), 13.2%(13/98), p<0.01). The pregnancy rates of hFF treated group (42.1%(16/38)) were slightly higher than control group (28.1%(9/32), p>0.05). But, the pregnancy rate of group which possessed more than one cleavaged zygote at 24 hours was higher than group which did not (45.2%(19/42) vs. 21.4%(6/28), p<0.05). From these results, the development of zygotes were faster in higher acrosome reacted sperm group than lower acrosome reacted sperm group after ICSI. Our results may be explained that acrosomal membrane and plasma membrane are easily detached from spermatozoa in acrosome reacted spermatozoa compared with acrosome intact sperm in the cytoplasm of oocyte during pronuclear formation. We conclude that the injection of acrosome reacted spermatozoa will increase the pregnancy rate as they can induce fast embryonic development in ICSI.