• 한국동물생명공학회지
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• 제37권2호
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• pp.96-105
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• 2022

The ovary undergoes substantial physiological changes along with estrus phase to mediate negative/positive feedback to the upstream reproductive tissues and to play a role in producing a fertilizable oocyte in the developing follicles. However, the disorder of estrus cycle in female can lead to diseases, such as cystic ovary which is directly associated with decline of overall reproductive performance. In gene expression studies of ovaries, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qPCR) assay has been widely applied. During this assay, although normalization of target genes against reference genes (RGs) has been indispensably conducted, the expression of RGs is also variable in each experimental condition which can result in false conclusion. Because the understanding for stable RG in porcine ovaries was still limited, we attempted to assess the stability of RGs from the pool of ten commonly used RGs (18S, B2M, PPIA, RPL4, SDHA, ACTB, GAPDH, HPRT1, YWHAZ, and TBP) in the porcine ovaries under different estrus phase (follicular and luteal phase) and cystic condition, using stable RG-finding programs (geNorm, Normfinder, and BestKeeper). The significant (p < 0.01) differences in Ct values of RGs in the porcine ovaries under different conditions were identified. In assessing the stability of RGs, three programs comprehensively agreed that TBP and YWHAZ were suitable RGs to study porcine ovaries under different conditions but ACTB and GAPDH were inappropriate RGs in this experimental condition. We hope that these results contribute to plan the experiment design in the field of reproductive physiology in pigs as reference data.

• 한국수정란이식학회지
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• 제16권3호
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• pp.183-191
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• 2001

본 연구는 고품질육의 DNA marker가 규떵된 한우로부터 초음파유노 난포란의 연속적 채취를 통하여 능력이 우수한 한우 수정란온 대량생산하는 방법의 확립과 이를 한우농가에 응용하고자 초음파 난자채취기를 이용하여 등지방층두께, 일당증체량, 근내지방도 및배최장근 단면적에 연관된 DNA marker를 보유하고 있는 한우 5두로부터 개체및 난포수, 채취방법, 회수한 난포란의 등급 등을 조사하였다. 한우 5두의 개체별 난포수는 6, 10, 5, 4 및 11회 관찰하여 각각 59개(9.8$\pm$4.5개), 82개(8.2$\pm$4.8개), 83개(16.6$\pm$2.6개), 50개(12.5$\pm$0.5개) 및 79개(7.2$\pm$3.1개)였으며, 모두 36회에 걸쳐 관찰하였던 바 353개(9.8$\pm$4.9개)의 난포를 확인할 수 있었다. 전체 난포수는 small(227개), medium(112개), large follicles(14개) 순으로 나타났으며, 개체별 평균 난포수는 5101번 개체가 평균 16.6$\pm$2.6개로써 가장 높았다. 개체별 난포란의 회수율은 5101번 개체가 89.3%(50/56 ; >2mm) 및 94%(47/50 ; $\leq$2mm)로써 가장 높게 나타났으며, 5두 전체 회수율은 $\leq$2mm(손가락 촉지)가 85.7%(132/154)로써 >2mm (초음파 image)의 74.2%(201/271)보다 유의적 (P<0.01)으로 높게 나타났다. >2mm의 난포에서 채취한 회수란의 등급은 각각 1.0%(G I). 5.0%(G II), 31.3%(G III) 및 62.7%(G IV)로 나타났으며, $\leq$2mm의 난포로부터 채취한 회수란을 각각 2.3%(G I), 16.7%(II),38.6%(G III) 및 42.4%(G IV)의 등급별 회수을 보였다. 1등급(G I) 난포란은 2~6mm 난포에서 1개(1.1%)였으며, 2등급(G II)은 $\leq$2mm, 2-6mm 및 $\geq$6mm 난포에서 각각 5개(3.3%), 11개(11.7%) 및 3개(33.3%)로써 $\geq$6mm 난포에서 가장 높게 나타났다. 3등급(G III) 난포란도 각각 43개(28.9%). 35개(37.2%) 및 5개(55.6%)로써 $\geq$6mm 난포에서 가장 높았으나, 4등급(GIV) 난포란은 $\geq$6mm 난포에서 1개(11.1%)로써 $\leq$2mm 및 2-6mm 난포에서의 101개(67.8%) 및 47개(50.0%) 보다 매우 낮게 나타났다. 전체 회수 난포란수도 4등급이 59.1%(149/252)로써 1, 2, 3등급의 0.4% (1/252), 7.6%(19/252) 및 32.9%(83/252)보다 높게 나타났다. 1회 평균 회수 난포란은 $\leq$2mm 난포에서 4.8$\pm$3.7개로써 2-6mm(3.0$\pm$3.4개) 및 $\geq$6mm (0.3$\pm$0.6개)보다 높았으며, 1회당 평균 8.1$\pm$5.1개의 난포란을 회수하였다.

• 한국양식학회지
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• 제8권3호
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• pp.171-181
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• 1995

붕어의 년 생식주기를 밝히기 위해 1993년 2월부터 1994년 10월까지 gonadosomatic index (GSI)를 조사하였다. GSI는 4월부터 7월까지는 높은 수준을 나타내며 개체간에 편차가 큰 것으로 보아 이 기간이 산란기임을 보여준다. 8월부터 9월까지는 년중에서 가장 낮은 수준이며 이때 난소내 여포는 퇴화가 진행 중이었다 10월부터 GSI 값은 증가하여 이듬해 3월에 최대치를 보였다. Human chorionic gonadotropin (HCG 10 lU), $17\alpha$, 20\beta-dihydroxyprogesterone\;(1-100{\mu}g/ml)$ 및 phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA, protein kinase C activator, 0.1-10${\mu}M$)는 인공배양 시 난모세포의 성숙을 유도하였으나 $4\alpha-phorbol$ 12, 13-didicanoate ($4\alpha-PDD$, phorbol ester analogue, $(25{\mu}M$)는 성숙을 일으키지 않았다. 또한, HCG (10 IU), prostaglandin $F_{2\alpha}$ (0.1-10${\mu}g/ml$) 및 TPA (0.1-10${\mu}M$)는 난모세포의 배란을 유도하였으나 $4\alpha-PDD$$(25\;{\mu}M)$에 의해서는 배란이 일어나지 않았다. 여포세포의 $17\alpha-hydroxyprogesterone$은 HCG (1 IU, 10 IU) 및 forskolin (adenylate cyclase activator, 0.1-10 ${\mu}M$)에 의해 생성이 촉진되었으며 HCG (10 IU) 및 forskolin $(10 {\mu}M)$에 의한 time course 는 3시간 내에 생성량이 증가하여 시간경과에 따른 유의한 차이는 보이지 않았다. 이러한 결과를 종합하면 cyclic AMP와 protein kinase C 는 어류의 난모세포의 성숙과 배란과정에 매우 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권3호
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• pp.293-302
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• 1997

Follicular oocytes of Grade I and II were collected from 2~6 mm ovarian follicles and matured in vitro (IVM) for 24 hrs in TCM-199 su, pp.emented with 35$\mu\textrm{g}$/ml FSH, 10$\mu\textrm{g}$/ml LH, and 1$\mu\textrm{g}$/ml estradiol-17$\beta$ at 39$^{\circ}C$ under 5% CO2 in air. They were fretilized in vitro (IVF) by epididymal spermatozoa capacitated with heparin for 12 hrs. The zygotes were then co-cultured in vitro with bovine oviducted epithelial cells (BOEC) for 7 to 9 days. The optimal time for IVM, the successful enucleation of IVM oocytes by micromanipulation at different oocyte ages after IVM, and the ideal culture system for IVM for effective IVF and in vitro development of IVM-IVF embryos was examined for in vitro production of nuclear recipient oocytes and nuclear donor embryos. To improve the efficiency of nuclear transplantation (NT) of IVF embryo into IVM follicular oocytes, this study evaluated the optimal electric condition and oocytes age for activation of IVM oocytes and in vitro development of NT embryos. In vitro development of NT embryos with preactivation or non-preactivation in enucleation oocytes, cell number of IVN-IVF embryos, and NT embryos wre also examined. The results obtained were as follows; 1. The most suitable enucleation time was at 24 hpm (83.3%) rather than that of 28 hpm(69.6%) and 32 hpm(50.0%). 2. There was no difference among the fusion rates of NT embryos at the voltages of 0.75, 1.0 and 1.5 kV/cm, but the in vitro development rates to morule and blastocyst were significantly (P<0.05) higher at the voltage of 0.75(12.5%) and 1.0kV/cm (12.6%) compared to 1.5kV/cm(0%). 3. No significant difference in activation rates were seen in NT embryos stimulated for 30, 60 and 120 $\mu$sec (71.7, 85.2 and 71.9%, respectively), but the in vitro development rates to morulae and blastocyst were significantly (P<0.05) higher in the oocytes stimulated for 30 $\mu$sec (11.6%) and 60 $\mu$sec(10.7%) than 120 $\mu$sec(0.0%). 4. The fusion rates (71.0 and 87.3%) and the in vitro development rates (9.1 and 12.7%) to morula and blastocyst were seen in the NT embryos stimulated at 28 and 32 hpm under the condition of 1.0 kV/ml, 60 $\mu$sec. However, at 24 hpm the fusion rates were 64.8% and the in vitro development to morula and blastocyst were not seen. 5. The fusion rates between the 8~12, 13~17 and 18~22-cell stage of IVM-IVF embryos were not significantly different. The in vitro development rates of the fused embryos to morula and blastocyst which were received from a blastomere of 8~12, 13~17 and 18~22-cell stages of IVM-IVF embryos were 14.9, 8.3 and 6.5%, respectively. 6. The in vitro development rate of the enucleated recipient oocytes with preactivation (24.2%) to morula and blastocyst was significantly (P<0.05) higher than that of non-preactivation (12.8%). 7. The cell numbers of NT blastocyst and IVM-IVF blastocyst cultured during 7~9 days were 63$\pm$11 and 119$\pm$23, and then their the mean cell cycle number were 5.98 and 6.89, respectively.

• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.105-112
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• 2005

본 연구는 재래산양에서 복제 수정란의 생산효율을 향상시키기 위한 기초 자료를 제시하고자 체세포 핵이식을 실시하여 공핵세포의 종류, 핵이식란의 활성화 처리 방법 및 수핵난자의 조건이 체외발달율에 미치는 영향을 조사, 검토하여 핵이식란 생산을 위한 최적의 조건을 규명하고자 실시하였다. 공핵세포의 종류에 따른 핵이식란의 체외발달율은 융합이 이루어진 핵이식란의 활성화 처리 후 분할율은 귀 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때가 $40.5\%$로서 태아 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때의 $55.5\%$와 유의적인 차이가 없었다. 또한 상실배 또는 배반포기로의 발달율도 각각 $6.7\%$ 및 $16.0\%$로서 유의적인 차이가 없었다. 핵이식란의 활성화 방법에 따른 체외발달율은 ionomycin+6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 $79.0\%$로서 전기자극을 주었을 때의 $9.5\%$보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다. 상실배 또는 배반 포기로의 발달율도 ionomycin+6-DMAP 처리를 하였을 때는 $15.6\%$가 발달하였으나, 전기 자극을 주었을 때는 4-세포기 이후로의 발달이 전혀 이루어지지 않았다. 체세포 핵이식란은 단위발생란에 비하여 분할율$(66.1\%\;vs\;59.18\%)$ 및 상실배 또는 배반포배로의 발달율$(19.0\%\;vs\;0.0\%)$이 유의적 (P<0.05)으로 낮았다. 단위발생란의 분할율은 체내 성숙난자에서 $86.8\%$로서 난포란의 $69.0\%$보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다 단위발생란의 상실배 또는 배반포기로의 발달율에 있어서도 체내 성숙난자$(50.0\%)$가 난포란$(23.6\%)$보다 유의적 (p.<0.05)으로 발달율이 높았다. 이상의 결과로 볼 때 재래산양의 체세포를 이용한 복제수정란의 생산효율을 향상시키기 위해서는 다수의 난자 확보를 위한 과배란처리 방법의 개선, 난포란의 이용효율 개선 및 활성화 처리방법 등이 확립되어야 하며, 후기배로의 발달율 향상을 위해서는 최적의 체외 배양조건 확립이 시급한 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권3호
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• pp.169-175
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• 2006

본 연구에서 돼지 난포란에서 채취된 난모세포들을 체외 성숙 후 세포 손상이 없이 성숙 난모세포의 발생능을 알아낼 수 있는 마커로 극체의 방출이 효과적으로 활용될 수 있는지를 알아보았다. 난모세포를 48시간 성숙 배양 후 극체의 방출 유무를 검사하고, 핵염색하여 염색체의 형태를 검사하였다. 확인된 난모세포들을 $16{\sim}18$시간 추가 배양한 후 7% ethanol로 활성화시키고 $5{\mu}g/ml$ cytochalasin B에 5시간 노출 후 NCSU23 배양액으로 7일간 배양하였다. 극체 방출율은 반복에 따라 $9.9{\sim}52.4%$, 퇴행율은 $21.4{\sim}61.8%$로 변이가 크게 나타났다(p<0.01). 극체를 방출한 난모세포의 핵상은 모두 극체와 19개의 염색체를 가진 제 2 감수분열 중기 핵상을 보여주었으며, 극체를 방출하지 못한 난모세포의 핵상은 핵이 팽화된 상태인 핵형이 39.1%, PCC 형태의 핵상이 19.6%, MI 형태의 핵상이 10.9%, MII이지만 극체가 관찰되지 않거나 매우 작은 상태인 경우가 13%, 핵이 응축된 형태인 경우가 6.5%, 핵이 없는 경우가 8.7%로 나타났다. 퇴행란으로 판단한 난모세포들은 핵염색을 한 결과 역시 세포질 상태가 정상적이지 못한 염색 상태를 보여주었다. 극체 방출 유무를 확인하지 않고 활성화 처리 후 배양하였을 때 분할율은 45.0%, 배반포기까지 발달율은 11.3%였으나, 극체 방출란만을 모아서 활성화처리를 하였을 때 분할율은 94.2%, 배반포기까지 발달율은 42.5%로 급격하게 향상되었다. 이상의 결과로 퇴행란과 극체 미방출란을 제거하고 실험에 활용한다면 배양 효과를 확인하거나 배아 생명 공학에 활용할 때 좀더 유리 할 것으로 사료된다.

• 한국응용곤충학회지
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• 제59권1호
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• pp.25-35
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• 2020

호박꽃과실파리(Zeugodacus scutellata)는 국내 자생종으로 국제적으로는 검역 대상 과실파리 중 하나로 분류되고 있다. 불임충방사기술(sterile insect release technique (SIT))은 검역 대상 과실파리를 박멸하는 데 이용되어 왔다. 본 연구는 호박꽃과실파리를 대상으로 불임충 제조 기술을 개발하여 SIT 기술로 이 해충에 대한 방제 가능성을 분석하였다. 이에 앞서 먼저 형광현미경 기술로 호박꽃과실파리의 생식관련 기관을 관찰하였다. 다영양실형 난소소관을 갖는 1 쌍의 난소는 약 100 개의 난포를 발달시키며, 각 난포는 난모세포와 영양세포를 지니며 난포세포가 둘러싸는 구조를 지닌다. 난소 발육은 우화 후 10 일이 지나 발육을 시작하고 우화 후 20 일이 되면 난각을 가지고 있는 난모세포를 발달시켰다. 수컷의 경우 성숙된 정소가 우화 직후에 관찰되었으며 수정관에는 운동성이 있는 정자로 채워져 있었다. 불임 수컷을 제조하기 위해 다양한 선량(0~1,000 Gy)의 전자빔을 3~5 일 경과된 번데기에 조사하였다. 200 Gy 세기 전자빔으로 번데기에 조사하면 무처리와 차이 없이 성충으로 발육하였고 이후 정상 암컷과 교미행동을 보였다. 비록 이들 처리 수컷의 교미는 무처리 수컷과 비교하여 큰 차이 없는 산란력을 보였지만 산란된 알들은 부화하지 못했다. 다음으로 200 Gy 조사로 형성된 불임 수컷을 정상 암컷과 수컷이 함께 있는 장소에 방사하였다. 이때 불임충 수컷 은 정상 수컷에 비해 9 배 많은 수로 방사하였다. 이러한 불임충 처리는 차세대 부화율을 현격하게 감소시켰다. 이상의 결과는 200 Gy 세기의 전자빔으로 호박꽃과실파리의 불임충을 제조할 수 있고, 이렇게 형성된 불임충은 SIT 방제에 적용할 수 있다는 것을 제시하고 있다.

• Applied Microscopy
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• 제40권1호
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• pp.9-14
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• 2010

경골어류, 잉어과, 모래무지아과에 속하는 쉬리(Coreoleuciscus splendidus)의 난자형성과정을 광학현미경으로 관찰한 결과는 다음과 같다. 쉬리의 난소는 한 쌍으로 부레와 창자사이에 위치하고 있었으며 회색을 띠었다. 난소의 형태는 장타원형(장축 20 mm, 단축 5 mm)이었다. 난원세포는 다각형으로 세포질은 호염기성이었고 핵 안에 여러 개의 인들이 분포하고 있었다. 초기시기의 제1난모세포(primary oocyte)는 난원세포에 비하여 크기가 커졌으며 난황포(yolk vesicle)들은 핵 주변부에는 관찰되지 않았고 세포질의 가장자리에만 국한적으로 형성되기 시작하였다. 제1난모세포가 발달함에 따라서 난황포는 바깥 가장자리에서 안쪽으로 증식되어 핵 쪽으로 이동되었으며 난막 바깥쪽은 짙은 푸른색의 여포상피(follicular epithelium)로 싸여 있었다. 그러나 핵의 주변부는 아직 푸른색을 띠고 있었다. 제2난모세포는 세포질이 전체적으로 호산성이었으며 난황포가 세포질 전체에 분포하였다. 성숙한 난자는 난자의 크기가 상당히 커졌으며 난막이 두꺼워졌다. 또한 난황포는 난황괴(yolk mass)로 전환되었다. 이상과 같이 쉬리의 난자형성과정은 난세포의 크기 증가, 난황낭의 축적, 세포질 내 염기성 물질이 산성으로 전환 및 난막의 발달로 요약될 수 있으며 일반적인 다른 과의 담수경골어류와 큰 차이는 없는 것으로 확인되었다. 본 어종의 종특이성을 찾기 위해서 난막의 미세구조적 연구가 추가적으로 필요할 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권2호
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• pp.177-183
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• 1997

The present study examined the effects of epidermal growth factor(EGF) and transforming growth factor-$\alpha$(TGF-$\alpha$) on in vitro maturation of porcine follicular oocytes. Basic medium used TCM-HEPES, and oocytes cultured for 42 hours in vitro. The results obtained are as follows; 1. The nuclear maturation rates of EGF-treated groups(10ng/ml, 75.9% ; 30ng/ml, 69.2% ; 50ng/ml, 67.2% ; 100ng/ml, 71.0%) on the porcine oocytes cultured in medium without pFF in vitro were significantly(P<0.01) higher than those of non-treated group(57.1%). When the oocytes were cultured in media with 10%(v/v) pFF, the nuclear maturation rates of 30ng EGF/ml(77.1%) treated group were significantly(P<0.01) higher than those of non-(59.2%) and EGF-treated groups(10ng/ml, 65.4% ; 50ng/ml, 65.5% ; 100ng/ml, 70.4%). 2. The nuclear maturation rates of 30ng TGF-$\alpha$/ml treated group(71.9%) in media without pFF in vitro were significatnly(P<0.01) higher than those of non-(57.1%) and TGF-$\alpha$ treated groups(10ng/ml, 60.4% ; 50ng/ml, 65.4% ; 100ng/ml, 60.0%). When the oocytes were cultured in media with 10%(v/v) pFF, the nuclear maturation rates of 30 and 50ng TGF-$\alpha$/ml(77.4% and 79.6%) treated groups(10ng/ml, 64.2% ; 100ng/ml, 61.6%). 3. On the effect of EGF(30ng/ml) and/or TGF-$\alpha$(30ng/ml) treated groups in medium without pFF in vitro, the nuclear maturation rates indicated 57.3, 60.4, 75.9 and 79.7% in media with no EGF & TFG-$\alpha$, TGF-$\alpha$ only, EGF only nad EGF＋TGF-$\alpha$ treated groups, respectively. The nuclear maturation rates in medium with EGF only or EGF＋TGF-$\alpha$ were significantly(P<0.01) higher than those non- and TGF-$\alpha$ treated groups. When the oocytes were cultured in media with 10%(v/v) pFF, the nuclear maturation ratesof EGF＋TGF-$\alpha$ treated group(75.9%) were significantly(P<0.01) higher than those of non-(59.2%), TGF-$\alpha$ only (64.2%) and EGF only(69.4%) treated groups.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권3호
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• pp.221-225
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• 2011

This study was undertaken to evaluate the relationship between in vitro maturation and plasminogen activators (PAs) activity on porcine cumulus-oocytes complexes (COCs) exposed to oxidative stress. When COCs were cultured in maturation medium with hydrogen peroxide ($H_2O_2$), the proportion of the germinal vesicle breakdown (GVBD) and oocytes maturation were decrease with addition of $H_2O_2$, and were significantly (p<0.05) lower in medium with 0.1 mM $H_2O_2$ than control group. Also, the rate of degenerated oocytes was increased in as $H_2O_2$ concentration in eased. When COCs were cultured for 48 h, three plasminogen-dependent lytic bands were observed: tissue-type PA (tPA); urokinase-type PA (uPA); and tPA-PA inhibitor (tPA-PAI). PA activity was quantified using SDS-PAGE and zymography. When $H_2O_2$ concentration was increased, tPA and tPA-PAI activities also increased in porcine oocytes cultured for 48 h, but not uPA. In other experiment, embryos were divided into three groups and cultured in (1) control medium, (2) control medium with 1.0 mM $H_2O_2$ and (3) control medium with 1.0 mM $H_2O_2$ along with catalase in concentrations of 0.01, 0.1, and 1.0 mg/ml, respectively. $H_2O_2$ decreased the rate of GVBD and maturation in porcine COCs but catalase revealed protective activity, against oxidative stress caused by $H_2O_2$. In this experiment, tPA and tPA-PAI activities were higher in media with 1.0 mM $H_2O_2$ alone. Increasing concentration of catalase decreased tPA and tPA-PAI activities in porcine oocytes. These results indicate that the exposure of porcine follicular oocytes to ROS inhibits oocytes maturation to metaphase-II stage and increase the oocytes degeneration. Also, we speculated that increased ROS level may trigger tPA and tPA-PAI activities in porcine oocytes matured in vitro.