• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.169-174
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• 2005

본 연구는 배양액의 종류에 따른 돼지 난자의 성숙 및 단위발생란의 배반포 형성율을 검토하였으며, 배양액의 삼투압과 발달 시기에 따른 배양액의 삼투압 변화가 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 검토하였다. 실험 1에서 난포란을 NCSU-23 mWM 및 mKRB에 각각 성숙배양한 결과 성숙률은 $62.1\~71.3\%$로 배양액에 따른 차이가 없었다. 실험 2에서는 각각의 배양액으로 성숙된 난자를 활성화 처리 후 동일한 배양액으로 6일간 배양하여 발달율을 검토한 결과, 배반포 발육율은 NCSU-23에 배양 시 $22.9\%$로 타 그룹($0\~0.6\%$)보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 실험 3에서는 단위발생란을 NaCl 안에 의해 256, 280 및 300 mOsmol(mOsm)로 조정한 NCSU-23에 6일간 배양한 결과, 배반포 발육율은 $11.0\~14.4\%$로 실험군 간에 유의적인 차이는 없었으나 삼투압이 낮을수록 난자의 fragment 비율이 높게 나타났다(P<0.05). 실험 4에서는 단위발생란을 삼투압이 조정된 세 종류의 NCSU-23에 48시간 배양한 후 삼투압이 높거나 낮은 NCSU-23으로 옮겨 4일간 추가 배양한 결과 배반포 형성율은 배양 48시간 후에 배양액의 삼투압을 낮춰 주었을 때($21.0\%$)가 높여 주었을 때 ($11.8\%$) 보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).본 실험의 결과는 돼지 단위발생란의 발육이 배양액의 종류 및 삼투압에 의해 영향을 받으며, 배양액의 삼투압은 돼지 단위발생란의 발육 단계별로 영향을 주어, 초기에는 높은 삼투압의 배양액에서 배양하고 일정 시간 후 낮은 삼투압의 배양액으로 배양함으로써 발육이 증진될 수 있음을 시사한다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.201-205
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• 2005

본 연구는 아미노산의 첨가가 돼지 수정란의 체외 발달율에 미치는 영향을 구명하고자 PEF가 함유된 NCSU-23을 기본배지로 체외성숙 및 체외배양액을 조성한 후 EA(Essential amino acid), NA(Non-essential amino acid) 및 EANA(EA+ NA)를 첨가하여 체외성숙, 체외수정 및 체외발달에 미치는 영향을 조사하였다. 체외성숙 배지에 아미노산을 첨가한 결과 MH 단계까지의 체외성숙율은 NA 첨가군이 $83.3\%$로 대조구 $70.0\%$에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높았다. 그러나 체외 수정 이후의 배 발달율과 수정율에서는 아미노산 첨가군과 무첨가군 사이에 유의적인 차이는 없었다. 체외배양액에 아미노산을 첨가한 후 배반포의 내부세포괴(ICM) 세포와 영양배엽(TE) 세포의 발달에 미치는 영향을 조사한 결과, ICM에서는 유의차를 발견할 수 없었으나 TE 세포는 EANA 처리구가 $18.0{\pm}0.5$개로 대조구 $16.09{\pm}0.56$개에 비해 유의적(p<0.05)으로 많았다. 총세포수에서도 EANA 처리구가 $50.0{\pm}1.0$개로 대조구 $44.2{\pm}1.1$개보다 유의적(p<0.05)으로 많았다. 이상의 결과를 종합할 때, 돼지의 체외수정란 생상에 있어서 아미노산의 첨가는 배반포로의 발달율에는 영향을 미치지 못하였으나 체외성숙율을 높이고 배반포의 세포수 향상에 도움을 주는 것으로 판단된다. 특히, 영양배엽(W) 세포의 발달율이 높은 것으로 보아 아미노산의 첨가는 돼지수정란의 착상에 도움을 줄 것이라 기대된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제24권3호
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• pp.311-318
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• 1997

Bypassing acrosome reaction and fusion process in intracytoplasmic sperm injection(ICSI), most of injected spermatozoa still contain intact acrosome contents and plasma membrane. It Is not known yet what acrosome contents and plasma membrane of spermatozoa have effect on the development of embryo. For further understanding of fertilization process after ICSI, we studied the time of pronucleus formation, disappearance and first cleavage in human zygote, and pregnancy rate in relation to acrosome reaction rate of spermatozoa after ICSI. Seventy cycles undergoing ICSI program were randomly selected. Sperm suspension from 38 cycles were treated 50% human follicular fluid(hFF) for 3 hours in order to induce acrosome reaction, others were not treated as control. Acrosome reaction in hFF treated and non-treated group was assessed by fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated Arachis hypogea(PNA) and Pisum sativum agglutinin(PSA). Oocytes were classified into 'good' and 'poor' according to their morphology. After ICSI, fertilization of oocytes were assessed by detection of two pronuclei at 16 hours. The pronuclei disappearance and first cleavage of zygotes were observed at 24 hours, and then embryos were transferred to uterus after culture for 72 hours. The rate of acrosome reaction of spermatozoa in hFF treated group was significantly higher than that in control(p<0.01). Fertilization rates of good oocytes were not different both control and hFF treated group(81.3%(174/206) vs. 72.1%(102/130)). But, in poor oocytes, the fertilization rates in hFF treated group(72.1%(149/183)) were increased compared than those of control group (63.6%(98/140), p<0.01). In either good or poor oocytes, the rates of pronuclei disappearance in hFF treated-spermatozoa injected oocytes were higher than control (59.1%(103/174), 56.4%(84/149) vs. 32.4%(33/102), 37.8%(37/98), p<0.01). Also, the rates of thirst cleavage were increased in hFF treated group (31%(54/174), 24.1%(36/149)) compared than those of control group (10.8%(11/102), 13.2%(13/98), p<0.01). The pregnancy rates of hFF treated group (42.1%(16/38)) were slightly higher than control group (28.1%(9/32), p>0.05). But, the pregnancy rate of group which possessed more than one cleavaged zygote at 24 hours was higher than group which did not (45.2%(19/42) vs. 21.4%(6/28), p<0.05). From these results, the development of zygotes were faster in higher acrosome reacted sperm group than lower acrosome reacted sperm group after ICSI. Our results may be explained that acrosomal membrane and plasma membrane are easily detached from spermatozoa in acrosome reacted spermatozoa compared with acrosome intact sperm in the cytoplasm of oocyte during pronuclear formation. We conclude that the injection of acrosome reacted spermatozoa will increase the pregnancy rate as they can induce fast embryonic development in ICSI.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.219-227
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• 2004

본 연구는 체외 성숙액인 TCM-199 배지를 기초로 무혈청첨가물인 PVA, PVP 및 pFF의 한정배지를 이용하여 돼지 미성숙난자의 체외성숙, 수정 및 배양 후 난자의 수정율과 배발달에 미치는 영향과 나아가 BSA 대체물로서의 이용 가능성을 알아보았다. 1. 무혈청 첨가물을 이용하여 난포란의 체외 성숙을 유기한 결과 PVA, PVP, pFF, BSA의 전체 분할율은 각각 82.4%, 78.6%, 89.4%, 90.0%로 나타났으며, GV, MI-MII율은 PVA 첨가시 각각 15.1%, 84.9%, PVP는 각각 26.5%, 73.5%, pFF는 각각 11.8%, 88.2%, BSA는 각각 11.1%, 88.9%로 PVA 혹은 pFF 첨가시에는 모두 BSA와 유사한 결과를 보였으나 PVP와는 유의적인 차이를 나타내었다 (P<0.05). 2. 체외 성숙된 난자를 수정시킨 후의 배발달율을 확인한 결과 전체 난할율은 PVA가 73%, PVP는 64.1% , pFF가 77.2%, BSA가 73%로 PVA와 pFF는 BSA와 유사하게 나타났으나, PVP는 그 발달율이 다른 처리군 들과 비교하여 유의적(P<0.05)으로 낮은 결과를 보였다. 3. 각 처리구간의 morulae와 blastocyst의 합을 비교한 결과 체외성숙 첨가물 중 PVA와 pFF는 각각 63%, 69%로 BSA(65%)와 유사한 결과를 나타내었으나 PVP는 54%로 유의적으로 낮은 결과를 나타내었다(P<0.05). 4. 전체 성숙율과 수정율을 비교해 본 결과 성숙 율은 PVA, pFF, BSA가 82.4%, 89.4%, 90.0%인 반면 PVP는 72.4%로 유의적으로(P<0.05) 낮은 결과를 보였고, 수정율은 pFF, BSA가 각각 87.1%, 89.1%로 PVA, PVP의 78.0%, 70.6%에 비해 각각 유의적(P<0.05)으로 높았다. 이상의 연구결과 돼지 난자의 체외성숙 및 배양 배지에 있어 PVA, pFF 첨가는 BSA 대체물로서 이용이 가능하나 PVP는 그 이용에 제한이 따를 것으로 판단된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권1호
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• pp.1-7
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• 2007

본 연구는 체외 성숙된 난자와 동결 융해 정자를 이용한 돼지의 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 정자 침투율, 웅성전핵 형성률 그리고 후기배로의 체외 발육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epidermal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간 배양하여 체외 성숙을 유도하였다. 성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결 융해정액을 이용하여 5mM caffeine과 10mM calcium chloride를 함유한 mTBM배양액에서 8시간 체외 수정하였다. 체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵 형성률을 조사하였고(실험 $1{\sim}3$) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3). 실험 1에서는 정자 농도를 $7.5{\times}10^5/ml$로 조정하여 나화 난자와 난구 세포 부착난자에서 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 $5{\times}10^6/ml$의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 $7.5{\times}10^5/ml$의 정자 농도로 체외 수정한 후 후기배로의 발육률을 조사하였다. 실험 1의 결과 정자 침투율은 나화 난자에 비해 난구 세포 부착 난자에서 유의적으로 감소되었다(35.2% vs. 77.4%; p<0.01). 실험 2에서 다양한 정자 농도에 의한 정자 침투율과 정상 수정률을 바탕으로 판단했을 때 $4.6{\times}10^6/ml$의 정자 농도가 다른 정자 농도에 비해 난구 세포부착 난자의 체외 수정에 적합한 것으로 나타났다. 체외 수정과정에서 난구 세포 부착된 상태로 수정된 난자는 나화 난자에 비해 유의적으로(p<0.05) 높은 분할률(48.8% vs. 58.9%), 배반포 형성률(11.0% vs. 22.8%)과 배반포 세포수$(22{\pm}2\;vs.\;29{\pm}2)$를 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 돼지의 체외 수정과정에서 난구 세포의 존재는 정자 침투를 저해하지만 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권2호
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• pp.101-107
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• 2006

본 연구는 돼지 수정란의 체외 성숙 및 체외 배양액의 retinol 첨가 효과를 규명하기 위하여 체외 성숙 및 체외 배양액에 retinol을 첨가하여 수정란의 체외 발달에 미치는 영향을 구명하고자 수행되었다. 체외 성숙 배양액에 retinol을 첨가한 결과 성숙율은 $66.7{\pm}6.0{\sim}69.2{\pm}5.3%$으로 각 처리구 간의 유의적인 차이가 없었다(p>0.05). 체외 수정 후 배반포로의 발달율은 $5{\mu}M$ 첨가구에서 $20.4{\pm}2.6%$의 발달율을 나타내어 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났으며, $10{\mu}M$ 첨가구에 있어서는 분할율과 배반포로의 발달율이 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 낮게 나타났다. 정상 수정율은 $59.3{\pm}9.6{\sim}73.0{\pm}7.3%$로 처리구간에 차이가 없었다. 다정자 침입율은 처리군 간에 유의차는 인정되지 않았다(p>0.05). 배반포로의 발달 후 세포수를 비교한 결과 대조구($29.8{\pm}1.0$)에 비해 $5{\mu}M(37.0{\pm}1.6)$ 첨가구에서 유의적으로(p<0.05) 많은 세포수를 나타내었다. 체외 배양액에 retinol을 첨가한 후 발달율을 조사한 결과, 난할률, 상실배 및 배반포로의 발달율에서 모두 효과를 나타내지 못하였으며, 특히, $10{\mu}M$의 처리구에서는 대조구를 비롯한 타 처리구들보다 유의적으로(p<0.05) 발달율이 낮게 나타났다. 체외 성숙 배지와 체외 배양액 모두 retinol을 첨가한 결과 배반포로의 발달율에 있어서 각 처리구간의 유의적인 차이는 없었다. 이상의 결과를 종합할 때, 돼지 체외 성숙 배양액에 5 uM의 retinol의 첨가는 발달율과 세포수에 있어서 유의적으로(p<0.05) 효과적이었으며 10uM에서는 유해한 결과를 나타내었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.143-151
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• 2002

본 연구는 돼지의 미성숙 난포란을 체외에서 성숙, 수정시킨 후, 생산된 체외수정란을 NCSU23 체외배양액에 항산화제(NAC, ebselen 및 glutathione)와 성장인자(EGF와 PDGF)의 첨가가 돼지 체외수정란의 체외 발육에 미치는 영향을 검토하였다. NAC을 0, 0.5, 1.0 및 2.0mM 첨가하여 체외배양한 결과, 상실배기 이상 발육된 체외발육성적은 1.0mM과 2.0mM 첨가구가 여타구보다 높은 체외발육성적을 나타냈다. 한편, ebselen을 0, 5, 10 및 25$\mu$M을 첨가하여 배양한 경우 상실배 이상 발육된 체외발육 성적은 각각 17.9, 22.5, 36.9 및 10.8%로서 ebselen 10$\mu$M 첨가구가 여타구에 비해 다소 높은 체외발육성적을 얻었으나 통계적 유의차는 인정되지 않았다(P＞0.05). 또한 glutathione을 0, 50, 100 및 200$\mu$M 첨가시 상실배기 이상 발육된 체외발육성적은 각각 21.8, 17.4, 28.3 및 15.8%로서 100$\mu$M 처리구가 여타구보다 다소 높은 체외발육성적을 얻었으나 통계적 유의차는 인정되지 않았다(P＞0.05). 돼지 체외수정란의 체외배양시 체외배양액에 growth factor의 첨가배양이 돼지수정란의 체외발육에 미치는 영향을 검토한 결과, NCSU 23배양액에 EGF를 0, 10, 50 및 100ng/$m\ell$ 첨가시 상실배기이상 발육된 체외 발육 성적은 각각 19.7, 29.0, 26.6 및 40.4%로서 EGF 100ng1m1 처리구가 여타구보다 통계적으로 유의하게 높은 체외발육 성적을 나타냈으며(P＜0.05), PDGF를 0, 1, 5 및 10ng/$m\ell$ 첨가하여 배양한 경우 상실배기 이상 발육된 체외발육성적은 각각 22.0, 21.6, 33.9 및 15.9%로서 PDGF 5ng/$m\ell$ 처리구가 여타구에 비해 높은 체외발육성적을 얻었다. 본 실험에서 체외수정후 생산된 배반포기 수정란의 세포수는 처리구간 커다란 차이는 인정되지 않았다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권2호
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• pp.165-172
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• 2004

본 연구는 보다 안정된 돼지 체외수정란 생산시스템 확립을 목적으로 체외성숙배양액 mNCSU-37, mNCSU-23 및 TCM-199 가 각각 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 10% pFF가 포함된 각각의 성숙배양액에서 최종동도가 1${\times}10^5/m{\ell}$ 의 농도로 체외수정 시킨 다음, NCSU-23 에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. TCM-199에서 성숙시킨 난자가 mNCSU-37 이나 mNCSU-23에서 성숙시킨 것보다 난핵포 붕괴율과 핵 성숙율에서 다소 낮은 경향을 보였으나 유의적인 차이는 아니었다. 2. 정자 침투율은 성숙배양액간 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 웅성정핵 형성율은 mNCSU-37 에서 성숙시킨 난자가 88.0%로 TCM-199 에서 성숙시킨 것의 71.1%보다 유의적으로 높았다.(p<0.05). 3. 난분할율은 mNCSU-37(52.3%)이나 mNCSU-23(53.7%)에서 성숙시킨 난자가 TCM-199(43.1%)에서 성숙시킨 난자보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 배반포발달율도 mNCSU-37이나 mNCSU-23에서 성숙시킨 것이 TCM-199에서 성숙시킨 것보다 다소 높았지만 유의적인 차이는 아니었다. 이상의 결과로 보아 돼지 미성숙 난포란 유래의 체외수정란 생산을 위한 체외성숙배양액으로 TCM-199보다 mNCSU-37이나 mNCSU-23이 적합한 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제16권3호
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• pp.203-211
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• 2001

성간별에 이용할 돼지 수정란을 체외수정 방법으로 생산하기 위하여 돼지 난소에서 채취한 난자를 NCSU 23 배지에서 eCG, hCG를 첨가한 상태에서 22시간, 첨가하지 않은 상태에서 22시간 체외성숙을 시킨 후 mTBM을 이용하여 여러가지 정자농도(5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 그리고 10.0$\times$$10^{5}$ )에 따라 6시간 수정시켰고, NCSU 23 배지에서 배양시켰다. 배양 후 44시간에 수정란의 분할률을 관찰하였고, 144시간에 배반포 형성율을 확인하였다. 성감별 방법은 체외수정으로 생산된 배반포를 돼지 Y-specific DNA primer를 이용하여 PCR 처리를 한 후 전기영동으로 491 bp에서 증폭된 band의 유무에 따라 암컷과 수컷의 성을 판정하였다. 1. 돼지 체외수정에서 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 및 10.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 수정란 분할률은 각각 55.95, 67.88, 60.18, 47,60%이었다. 2. 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 배반포 형성율은 각각 16.03, 22.40, 21.41, 12.37%이었다. 3. 31개의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 PCR을 이용한 성감별 결과는 18개가 수컷, 13개가 암컷으로서 각각 58.1%과 41.9%를 나타내었다. 이상의 결과로 보아 돼지의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 성감별시 PCR 기법이 신속하고 정확하게 성감별을 실시할 수 있는 방법으로 판단되었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제5권2호
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• pp.115-122
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• 2001

난자와 난포세포는 gap junction channel을 통해 긴밀한 연락을 주고받음으로써 난자의 발달이나 난포의 성장에 영향을 미친다. 본 연구는 같은 크기의 난포에서 나온 난자라고 하여도 cumulus cell(난구세포)들이 붙어있는 상태가 다르다는 것을 관찰, 이렇게 난구세포와의 서로 다른 연결상태를 갖는 난자의 재질에 차이가 있을 것으로 가정하고, 난자의 competence와 이때 난자와 난구세포 사이의 cell-to-cell communication에 관여하는 gap junction protein인 connexin(CX) 37과 CX 43의 발현 정도가 어떤 상관관계가 있는지를 알아보고자 수행하였다. 생후 3주일 된 생쥐에 PMSG를 주입하고 48시간 후에 난소를 적출하여 난포를 450 $\mu\textrm{m}$ 이상(large)의 난포와 200～400 $\mu\textrm{m}$(small) 난포로 분리하여 그 난자를 얻었다. 난자에 난구세포가 compact하게 붙어있는 것은 intact로(L1, Sl), 난구세포가 어느 정도 붙어 있거나, 하나도 붙어있지 않은 것은 partial/denuded로 그룹을 나누었다(LPD. SPD). 각 그룹의 난자를 체외에서 성숙시키고, 수정시켜서 발달율을 비교하였다. 각각의 CX의 mRNA 발현을 RT-PCR과 in situ hybridization으로 비교하였다. intact와 denuded 난자의 비율은 큰 난포의 경우는 55%와45%의 비율로, 작은 난포의 경우는 30%와 70%의 비율로 난포가 작을수록 denude상태의 난자가 많이 나왔다. 어떤 경우의 난자는 체외 성숙율은 차이가 없이 모두 97%이상 성숙하였다. 그러나, 수정률에서는 차이를 보여서 intact한 난자에서 높은 수정율을 보였으며, SPD의 경우, 가장 낮은 수정ㆍ발달율을 보였다. 난자의 경우, 주로 발현되는 것은 CX 37이었으며, CX 43은 발현되지 않았다. 난구세포의 경우, CX 43이 가장 높게 발현하였고, 그 다음으로 CX 37이 관찰되었다. 본 실험 결과, 같은 발달크기의 난포라고 하더라도 그 안에 존재하는 난자의 상태는 난구세포와 얼마나 밀접한 cell-to-cell communication을 이루고 있느냐에 따라 영향을 받는다는 것을 확인하였다. 본 연구결과 다음과 같이 결론 내릴 수 있었다. 1)아직 발달이 끝나지 않은 난포에서 나온 미성숙난자라고 하여도 난구세포와 밀접한 연결을 갖는 경우 성숙난자와 거의 같은 능력을 갖고 있으며, 2) 난자와 난구세포간의 gap junctional communication은 heterotypic channel로 이루어지고, 3) 본 연구에서 관찰한 CX 43과 CX 37 두 종류만으로는 intact와 denuded의 차이점을 설명할 수 없었다.