• Applied Biological Chemistry
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• 제47권1호
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• pp.33-40
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• 2004

Ubiquitin 폴딩 반응의 초기에 나타나는 transient 폴딩 intermediate 상태의 열역학적인 특성을 연구하였다. 온도와 화학변성제의 농도를 바꾸어주면서 측정한 폴딩 kinetics의 결과로부터 unfolded 상태와 intermediate 상태의 평형상수 및 자유에너지를 quantitative kinetic modeling을 통하여서 구하였으며 또한 온도에 따른 자유에너지의 변화로부터 unfolded 상태에서 intermediate 상태로 전환될 때의 열역학적 함수인 ${\Delta}H,\;{\Delta}S,\;{\Delta}C_p$를 구하였다. Ubiquitin이 unfolded 상태에서 intermediate 상태가 될 때의 ${\Delta}C_p$는 unfolded 상태에서 native 상태로 되는 과정의 ${\Delta}C_p$의 약 80% 정도 되었다. 이것은 intermediate가 native 상태에 가까운 매우 조밀한 구조를 이루고 있는 ensemble state임을 나타낸다. 상온에서의 ${\Delta}H$는 양의 값을 보였다. 이는 ubiquitin의 unfolded 상태에서 소수성 잔기 주위에 위치한 물 분자의 규칙적인 구조가 intermediate 상태가 될 때 와해되기 때문이라고 여겨진다. 이러한 양의 enthalpy는 자유로워진 물 분자에 의한 전체 계의 entropy의 증가에 의하여서 보상되어 unfolded 상태에서intermediate 상태로의 전환은 음의 자유에너지를 갖게 되며 폴딩 반응의 초기에 관찰되는 것으로 여겨진다.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제31권10호
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• pp.2877-2883
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• 2010

The folding kinetics of $WT^*$ ubiquitin variant with valine to alanine mutation at sequence position 26 (HubWA) was studied by stopped-flow fluorescence spectroscopy. While unfolding kinetics showed a single exponential phase, refolding reaction showed three exponential phases. The semi-logarithmic plot of urea concentration vs. rate constant for the first phase showed v-shape pattern while the second phase showed v-shape with roll-over effect at low urea concentration. The rate constant and the amplitude of the third phase were constant throughout the urea concentrations, suggesting that this phase represents parallel process due to the configurational isomerization. Interestingly, the first and second phases appeared to be coupled since the amplitude of the second phase increased at the expense of the amplitude of the first phase in increasing urea concentrations. This observation together with the roll-over effect in the second folding phase indicates the presence of intermediate state during the folding reaction of HubWA. Quantitative analysis of Hub-WA folding kinetics indicated that this intermediate state is on the folding pathway. Folding kinetics measurement of a mutant HubWA with hydrophobic core residue mutation, Val to Ala at residue position 17, suggested that the intermediate state has significant amount of native interactions, supporting the interpretation that the intermediate is on the folding pathway. It is considered that HubWA is a useful model protein to study the contribution of residues to protein folding process using folding kinetics measurements in conjunction with protein engineering.

• 대한화학회지
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• 제67권2호
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• pp.81-88
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• 2023

HubWA 단백질을 모델로 삼아 소수성 아미노산이 folding 반응에 끼치는 영향을 탐색하기 위하여 HubWA에 있는 I와 L을 V로 치환한 변이 단백질의 folding kinetics를 측정하였다. 변이 단백질의 folding kinetics는 HubWA 단백질과 마찬가지로 three-state on-pathway mechanism(U ⇌ I ⇌ N, U는 unfolded 상태, I는 중간단계, N은 native 상태를 의미한다)을 따르는 것으로 나타났다. Folding kinetics 분석을 통하여 three-state 반응의 elementary 반응과 전체 반응의 자유에너지인 ΔG^o_UI, ΔG^o_IN, ΔG^o_UN을 얻었고, 변이 단백질의 자유에너지와 HubWA 단백질의 자유에너지의 차(ΔΔG^o_UI = ΔG^o_UI(변이 단백질) - ΔG^o_UI(HubWA), ΔΔG^o_UN = ΔG^o_UN(변이 단백질) - ΔG^o_UN(HubWA))의 비인 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN를 통하여 중간단계가 전체 folding 반응에 끼치는 영향을 각 소수성 잔기 별로 알아볼 수 있었다. HubWA의 입체구조에서 α-helix와 β-sheet가 상호작용하는 소수성 코어에 위치하는 아미노산인 I3, I13, L15, I30, L43, I61, L67을 V로 치환한 변이 단백질의 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN 값이 ~0.5로 나타난 점은 이들 아미노산이 중간단계에서 native 상태보다는 느슨하지만 비교적 견고한 구조를 이루는 것으로 해석되었다. HubWA 입체구조에서 α-helix의 아미노말단에 위치하는 I23, 특정 이차구조가 없는 부위에 위치하는 I36, β-strand 5의 카복실말단에 위치하는 L69를 V로 치환한 변이 단백질의 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN 값이 0.4 이하로 나타난 것은 이들 아미노산 잔기가 중간단계에서는 비교적 느슨한 구조를 이루다 중간단계에서 native 단계로 진행하는 folding 과정의 후반부에 HubWA의 입체구조에 견고하게 편입되는 것으로 해석되었다. HubWA의 입체구조에서 두 번째 β-strand의 카복실말단에 위치한 V17, 짧은 네 번째 β-strand의 카복실말단에 위치한 L50, 짧은 3₁₀-helix의 아미노말단에 위치한 L56이 중간단계에서 서로 상호작용을 하는 점은 이들 아미노산을 V로 치환한 변이 단백질의 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN값이 0.8 이상으로 나타난 점을 통하여 알 수 있었다. L50과 L56은 짧은 β-strand와 3₁₀-helix를 제외하고 특별한 이차구조가 존재하지 않는 부위(46번째 아미노산 잔기부터 62번째 아미노산 잔기 까지)에 위치하는데, 이들 아미노산이 V17과 더불어 folding 반응의 초기에 견고하게 상호작용을 하는 것은 HubWA단백질이 folding 과정의 초기에 응집체를 형성하는 것을 막아주는 역할을하는 것으로 생각되었다.

• 대한화학회지
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• 제58권6호
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• pp.560-568
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• 2014

단백질 폴딩 반응에서 정전기적 상호작용의 역할을 라이신 29를 알라닌으로 치환한 변이 유비퀴틴을 사용하여 탐색하였다. 유비퀴틴의 입체구조에서 라이신 29의 곁사슬은 글루탐산 16과 아스파르산 21의 곁사슬과 근접한 거리에 있어서 곁사슬끼리 정전기적 상호작용을 통하여서 삼차원 입체구조를 안정화시킬 것으로 예측되었다. 라이신을 알라닌으로 치환하여 정전기적 상호작용을 제거하였을 때 유비퀴틴의 native state의 구조적 안정성이 ~20% 감소한 점은 라이신 29에 의한 정전기적 상호작용이 단백질 삼차구조의 안정성에 상당히 기여하고 있다는 점을 시사하였다. 폴딩 반응의 진행 과정을 stopped-flow 장치로 측정한 folding kinetics 실험은 이전에 관찰된 것과 마찬가지로 unfolded state에서 native state로 진행하는 과정에 중간단계를 거치는 three-state on-pathway 메커니즘을 따르는 것으로 나타났다. 더욱이 라이신 29에 의한 정전기적 상호작용이 중간단계의 구조적 안정성에 기여하는 정도가 native state의 구조적 안정성에 기여하는 정도의 ~55%인 것으로 나타났다. 이는 유비퀴틴 폴딩의 중간단계의 구조도 라이신 29에 의한 정전기적 상호작용에 의하여 상당히 안정화 된다는 것을 의미하며 따라서 정전기적 상호작용이 단백질 삼차원 입체구조의 골격이 완성된 폴딩의 마지막 단계에 형성되어 단백질 native state의 안정성에만 기여하는 것이 아니라 중간단계가 형성되는 폴딩 반응의 초기에도 형성되어 폴딩 반응을 이끌어가는데도 기여한다는 것을 의미한다.

• BMB Reports
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• 제37권6호
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• pp.676-683
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• 2004

The conformational properties of hydrophobic core variant ubiquitin (Val26 to Ala mutation) in an acidic solution were studied. The intrinsic tryptophan fluorescence emission spectrum, far-UV and near-UV circular dichroic spectra, the fluorescence emission spectrum of 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid in the presence of V26A ubiquitin, and urea-induced unfolding measurements indicate this variant ubiquitin to be in the partially folded molten globule conformation in solution at pH 2. The folding kinetics from molten globule to the native state was nearly identical to those from the unfolded state to the native state. This observation suggests that the equilibrium molten globule state of hydrophobic core variant ubiquitin is an on-pathway folding intermediate.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제29권4호
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• pp.741-748
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• 2008

We have studied the folding mechanism of $\beta$ -hairpins in the proteins 1GB1, 3AIT and 1A2P by conducting unfolding simulations at moderately high temperatures. The analysis of trajectories obtained from molecular dynamics simulations in explicit aqueous solution suggests that the positions of the hydrophobic core residues lead to subtle differences in the details of folding dynamics. However, the folding of three different hairpins can be explained by a unified mechanism that is a blend of the hydrogen-bond-centric and the hydrophobiccentric models. The initial stage of $\beta$-hairpin folding involves various partially folded intermediate structures which are stabilized by both the van der Waals interactions of hydrophobic core residues and the electrostatic interactions of non-native hydrogen bonds. The native structure is obtained by forming native contacts in the final tune-up process. Depending on the relative positions of the hydrophobic residues, the actual mechanism of hairpi n folding may or may not exhibit well-defined intermediates.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제30권7호
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• pp.1567-1572
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• 2009

Conformational change of ubiquitin variant with valine to alanine mutation at sequence position 26 was studied by varying solvent pH. Fluorescence emission spectra indicated that this variant ubiquitin has some residual structures in acidic and basic solution as compared to denaturant-induced unfolded state. Far-UV circular dichroic spectra indicated that the base-denatured state had more secondary structure than the acid-denatured state. Near-UV circular dichroic spectra indicated that the aromatic side-chains were in the relatively more rigid environment in the base-denatured state than those in the acid-denatured state. Although it appears that the more tertiary structure present in the base-denatured state, refolding reactions measured by stopped-flow fluorescence device suggest that both the acid- and base-denatured states occur before the major folding transition state. The acid- and base-denatured states are considered to reflect the early event of protein folding process.

• 한국생물물리학회:학술대회논문집
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• 한국생물물리학회 1996년도 정기총회 및 학술발표회
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• pp.13-13
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• 1996

Aggregation of human $\alpha$$_1$-antitrypsin ($\alpha$$_1$-AT) during folding occurs both in vitro and in vivo. In vivo aggregates of mutant $\alpha$$_1$-AT such as $M_{malton}$ (Phe52 deleted) and Z (Glu342 longrightarrowLys) variants have pathological consequences. In order to analyze the process of $\alpha$$_1$-AT aggregation in detail, the folding-unfolding kinetics of $\alpha$$_1$-AT was examined by monitoring intrinsic Trp fluorescence and ANS binding. (omitted)

• BMB Reports
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• 제32권6호
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• pp.521-528
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• 1999

The folding of recombinant hepatitis B virus X-protein (rHBx) solubilized from Escherichia coli inclusion bodies was investigated. By sequential dialysis of urea, rHBx was folded into its native structure, which was demonstrated by the efficacy of its transcriptional activation of the adenovirus major late promoter (MLP), fluorescence spectroscopy, and circular dichroism (CD) analysis. The decrease in CD values at 220 nm and a corresponding blue shift of the intrinsic fluorescence emission confirmed the ability of rHBx to refold in lower concentrations of urea, yielding the active protein. Equilibrium and kinetic studies of the refolding of rHBx were carried out by tryptophan fluorescence measurements. From the biphasic nature of the fluorescence curves, the existence of stable intermediate states in the renaturation process was inferred. Reverse phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis further demonstrated the existence of these intermediates and their apparent compactness.

• 한국생물물리학회:학술대회논문집
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• 한국생물물리학회 1999년도 학술발표회 진행표 및 논문초록
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• pp.39-39
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• 1999

Single chain-monellin (SCM) was recently constructed by fusing the two chains of monellin. From the view of protein folding, SCM serves as an ideal model system especially in tackling ${\alpha}$-helix-${\beta}$-sheet interactions due to the following reasons： First, it consists of simple distinct structural elements (${\alpha}$-helix and ${\beta}$-sheet) which are assembled in a perpendicular manner.(omitted)