Kinetics of anaerobic ethanol fermentation by Clostridium thermohydrosulfuricum were investigated for the one-step production of ethanol from starch. A mutant strain with a high ethanol yield was induced from C. thermohydrosulfuricum. The mutant, designated as ME4, produced anaerobically 6.1 g/l of ethanol, 3.1 g/l of lactate and 0.1 g/l of acetate from 20 g/l of starch at $68^{\circ}C.
Fusant FSC14-75의 산업적 이용가능성을 검토하기 위한 최종 실험으로서 Working volume이 300 liters인 pilot scale에서의 발효력을 조사하였다. 13,3%의 liquefied sweet potato starch (Total sugar=14.8%)을 ethanol 발효원으로 함유한 fermentation broth 300liters를 0.6% seed로 발효시킨 결과 발효 최종일인 8일만에 6.6%(v/v)의 ethanol을 생성하였고 이때 잔당은 15%이었으므로 발효율은 총당에 대해서는 70%, 소비당에 대해서는 87.5%로 나타났다. 한편 fermentation broth로부터 FSC-14-75 유래의 unicellular cell과 flocculent cell을 분리할 수 있었으며 이를 각각 FSC14-75(S)와 FSC14-75(F)로 명명하였고, 이들 두 균주의 ethanol 발효능을 mini-jar fermentor scale에서 조사한 결과 FSC14-75(F)가 ethanol productivity에 있어서 우수하였으며 15%의 liquefied potato starch로부터 발효 10일만에 8.1%(v/v)의 ethanol을 생성하여 발효율은 총당에 대해 75%였다. FSC-14-73 (F)의 ethanol productivity를 pilot scale에서 조사하기 위해 총당 15.33%의 liquefied sweet potato starch를 함유한 fermentation broth 300 liters를 1% seed로써 발효시킨 결과 ethanol 생성은 배양 8일만에 최대 7.7%(v/v)였으며 이때 잔당은 1.9%였다. 또한 FSC-14-75(F) 균주의 발효과정중 $\alpha$-amylase의 계속적인 작용효과를 검토하기 위하여 300 liters의 fermentation broth를 살균 후1% seed와 동시에 50$m\ell$의 Thermamyl을 재차 첨가하고 ethanol 생성을 조사한 결과 발효율 및 잔당은 첨가하지 않은 경우와 별다른 차이가 없었다.
To improve the fermentation characteristics(such as starch-degradability, ethanol tolerance, sugar and high-temperature tolerance) of recombinant haploid yeast Saccharomyces diastaticus K114, hybridization technique was used. The hybridization partner was S. diastaticus 1177 which had good glucoamylase activity and fermentabi- lity. The best hybrid HH64 showed improved ethanol tolerance, sugar and high-temperature tolerance. Especia- lly, the starch-fermentability was significantly improved, since the hybrid produced 1.60% (w/v) ethanol from 4% (w/v) starch, while the recombinant haploid K114 produced 1.30% (w/v) ethanol. The optimum temperature and pH for the starch-fermentation by the hybrid HH64 was 30$\circ$C and 5, respectively. The hybrid yeast HH64 produced 7.5% (w/v) ethanol directly from 20% (w/v) starch.
증자하지 않은 Cassava의 생전분의 ethanol 발효생산을 위하여 Aspergilius shirousami 가생산하는 당화효소를 이용하여 단순당화 및 동시당화 발효를 하였다. Cassava 생전분의 당화률은 증자한 것에 비해 30% 정도였으며 10배의 효소를 가하여도 60%밖에 안되었으나. 동시당화-발효에서는 당화율이 크게 증가하여 ethanol 생성량이 증자한 전분에 비해 90% 이상이 되었다.
Schwanniomyces castellii NRRL Y-2477에 의한 전분의 직접 알콜발효에 대한 연구를 수행하였다. 이 균주의 150g/l glucose에 대한 알콜발효능력은 사용기질의 94%를 이용하여 ethanol를 63.9g/l를 생성하였으며, 이때의 ethanol yeild를 0.45g-ethanol/g-glucose로서 일반적인 알콜발효 효모인 Sacch. cerevisiae보다는 약간 낮았다. 전분이 상온에서 최대로 용해될 수 있는 20g/l전분의 직접알콜 발효에서는 통기인 경우 ethanol의 생성없이 세포성장만이 이루어졌으며, 통기를 하지 않은 경우는 9.1g/l의 ethanol를 생성하여 ethanol yeild는 이론값의 88%를 나타내었다. 반면 100g/l의 dextrin을 이용한 알콜발효에서는 통기에 의하여 ethanol의 생성이 1.8배 증가하였으며, 또한 $CaCO_3$첨가에 의한 pH를 조절한 경우 조절하지 않은 경우보다 ethanol생성이 2.1배 증가한 34.5g/l의 농도로서 이때의 기질에 대한 발효능력은 82%이고 ethanol yeild는 이론값의 약 84%였다. 또한 150g/l dextrin의 알콜발효에서는 약 79%의 기질을 소모하면서 52.1g/l의 ethanol을 생성하였다. 따라서 Schwanniomyces castellii NRRL Y-2477 에 의한 전분의 직접 알콜발효에서의 율속단계는 전분의 가수분해 과정임을 확인하였다.
Transformant TSD-14와 C. tropicalis간의 이속 간 융합체인 FSC-14-75의 산업적 이용가능성을 검토하기 위하여 mini-jar fermentor(working volume=2.5liters)를 사용하여 ethanol 발효의 최적조건 및 ethanol productivity를 조사하였다. Thermamyl(u-amylase, Novo Co.)로서 액화시킨 liquefied potato starch를 15%, 20%, 25% 농도로서 발효를 한 경우 총당에 대해 약 80%의 발효율을 나타내었으며 이는 yeast extract의 첨가에 의해 향상되었다. Ethanol 발효조건으로는 pH 4.2가 pH 5.5에 비해 효과적이었으며, seed volume을 공업적 수준인 10%로 하면 4일만에 20%의 liquefied potato starch로부터 11.0%(v/v)의 ethanol을 생성하여 현재의 공업적 사용균주의 성적에 필적할만 하였다. 또한 본 균주는 현재의 공업적 ethanol 발효생산에서 발효기질로 실제 이응하고 있는 Cassava starch 혹은 barley 및 sweet potato starch 등을 원료로 하였을 때도 8.5%(v/v) 및 7.6%(v/v)의 ethanol을 직접적으로 발효 생산하였으며, 한편 이와 같은 raw starch를 원료로 할 경우는 yeast extract를 첨가하지 않아도 무방하여 이상의 결과로 본 효모균주는 당화, 발효를 동시에 찰 수 있는 효모로서 공업적 이용이 가능할 것으로 기대되었다.
Ethanol production by the simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of low-value rice wine cake (RWC) without cooking was investigated. RWC is the filtered solid waste of fermented rice wine mash and contains 53% raw starch. For the SSF, the RWC slurry was mixed with the raw-starch-digesting enzyme of Rhizopus sp. and yeast, where the yeast strain was selected from 300 strains and identified as Saccharomyces cerevisiae KV25. The highest efficiency (94%) of ethanol production was achieved when the uncooked RWC slurry contained 23.03% starch. The optimal SSF conditions were determined as 1.125 units of the raw-starch-digesting enzyme per gram of RWC, a fermentation temperature of $30^{\circ}C$, slurry pH of 4.5, 36-h-old seeding culture, initial yeast cell number of $2{\times}10^7$ per ml of slurry, 17 mM of urea as the nitrogen additive, 0.25 mM of $Cu^{2+}$ as the metal ion additive, and a fermentation time of 90 h. Under these optimal conditions, the ethanol production resulting from the SSF of the uncooked RWC slurry was improved to 16.8% (v/v) from 15.1% (v/v) of pre-optimization.
분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF)는 당화와 발효공정을 따로 수행하는 방법으로 최종 생성물인 글루코오스에 의해 억제 영향을 받기 때문에 반응에 진행됨에 따라 축적된 글루코오스의 농도가 높아지면 반응이 종결되는 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 효소의 양을 늘리는 방법이 있지만, 효소의 생산비용이 비싸기 때문에 경제적인 방법이 될 수 없다. 이러한 분리 당화발효 공정의 단점을 극복하기 위해서 동시당화발효 공정(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)은 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행한다. 동시당화발효 공정에서는 당화과정에서 글루코오스가 생성되자마자 효모가 발효과정을 통해 글루코오스를 바로 제거하기 때문에 반응기내에서 당의 축적을 최소화할 수 있다. 따라서 동시당화발효 공정은 최종 생성물의 억제 작용을 방지할 수 있고, 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있다. 본 연구에서는 동시당화발효에서 에탄올의 수율에 관여하는 조건들(pH, 반응온도, 효소 투입량, 반응시간)의 최적 조건을 찾는 연구를 수행하였다. 기질로는 감자전분을 사용하였고, 효소는 glucoamylase, 균주는 Saccharomyces cerevisiae가 각각 사용되었다. 동시당화발효의 최적의 조건은 pH 4, 온도 38로 나타났다. 최적의 조건으로 감자전분을 동시당화발효하였을 때 반응 18시간 후에 에탄올은 최대 수율 86%에 도달하였다.
증자하지 않은 cassava 생전분의 ethanol 발효생산을 위한 동시당화 -발효의 최적조건을 검토하였다. 생전분의 분해력이 가장 좋은 당화효소의 선별에서는 Asp. shirousami27이 가장 좋았으며 발효효모는 균주에 따라 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 동시당화-발효는 pH3.6에서 가장 높았으며 발효전 6$0^{\circ}C$에서 당화효소에 의한 전당화와 발효시 교반등이 발효속도 및 발효율에 효과가 있었고, 분쇄처리도 효과가 있었다. cassava 생전분의 동시당화-발효에서 5일간의 긴 발효 기간을 요구하는데 발효중 발효액의 성분 조사 결과 중간물인 glucoserk 축적되지 않는 것으로 당화과정이 속도결정단계임을 알 수 있다.
To improve the fermentation characteristics of the haploid starch-fermenting recombinant yeast strain K114/YIpMS$\Delta$R(LEU2/URA3) secreting both $\alpha$-amylase and glucoamylase was rare-mated with polyploid industrial yeast Saccharomyces sp. K35. The K35 strain had good fermentation-characteristics such as ethanol-tolerance, high temperature and sugar-tolerance, and high fermentation rate. Among the resulting 66 hybrids, the best strain RH51 was selected. The RH51 exhibited amylolytic activity of K114/YIpMS$\Delta$R(LEU2/URA3) as well as ethanol and sugar tolerance of K35. The optimum temperature of hybrid RH51 for starch fermentation was 34$\circ$C which was same as that of K35 but different from that (30$\circ$C) of K114/YIpMS$\Delta$R(LEU2/URA3). The optimum pH was 5.0. The optimum size of inoculum was 2% as the pellet (w/v) of yeast cells. The hybrid strain RH51 produced 7.0% ethanol (w/v) from 20% (w/v) soluble starch while K35 formed almost no ethanol, 0.3% (w/v). RH51 strain produced 7.5% (w/v) ethanol after 8 days in a 2.5 l fermenter containing 800 ml of 20% (w/v) soluble starch. The residual starch content in the fermentation medium was 1.68% (w/v), and therefore almost all the starch was fermented completely.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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