Human neutrophil elastase (HNElastase, EC 3.4.21.37), a causative factor of inflammatory diseases, was purified by Ultrogel AcA54 gel filtration and CM-Sephadex ion exchange chromatography. HNElastase was inhibited by phenylbutazone in a concentration dependent manner up to 0.4 mM, but as the concentration increased, the inhibitory effect gradually diminished. Binding of phenylbutazone to the human neutrophil elastase caused strong Raman shifts at 200, 440, and 1194 $cm^{-1}$. The peak at 1194 $cm^{-1}$ might be evidence of the presence $of\;-N=N-{\Phi}$ radical. The core area of the elastase, according to the visual molecular model of human neutrophil elastase, was structurally stable. A deeply situated active center was at the core area surrounded by hydrophobic amino acids. Directly neighboring the active site was one positively charged atom and two atoms carrying a negative charge, which enabled the enzyme and the drug to form a strong interaction. Phenylbutazone may form a binding, similar to a key & lock system to the atoms carrying opposite charges near the active site of the enzyme molecule. Furthermore, the hydrophobicity of the surrounding amino acid near the active site seemed to enhance the binding strength of phenylbutazone. Binding of phenylbutazone near the active site may cause masking of the active site, preventing the substrate from approaching the active site and inhibiting elastase activity.
포공영의 총 페놀함량에서는 열수 추출물 7.80$\pm$0.97 mg/g, 에탄올 추출물 9.12$\pm$0.51 mg/g으로 나타났다. 플라보노이드함량은 열수 추출물 54.20$\pm$1.95 mg/g, 에탄올 추출물 79.43$\pm$4.44 mg/g으로 항산화 활성에 관련된 페놀 및 플라보노이드 화합물들이 에탄올 추출물에 많이 존재함을 확인할 수 있었다. 전자공여능에 있어서도 포공영 에탄올 추출물이 열수 추출물 $IC_{50}$값에 비해 3배 정도의 뛰어난 활성을 보였다. 아질산염 소거능은 모든 pH 조건하에서 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 아질산염 소거능을 나타내었으며, pH가 증가할수록 감소하였다. SOD 유사활성을 측정한 결과 열수 추출물에서는 18.34$\sim$37.26 $\mu$g/mL, 에탄올 추출물에서는 16.60$\sim$49.03 $\mu$g/mL의 범위로 분석되었으며, 농도에 따른 유의적 증가현상을 나타내었다. Tyrosinase 및 elastase 저해활성은 모든 추출물에서 대조구에 비해 다소 약한 활성을 나타내었다. 포공영 추출물은 뛰어난 항산화 활성을 나타나 기능성 식품 및 화장품 소재로 개발 가능성이 높을 것으로 사료된다.
Elastase (EC 3. 4. 4. 7)는 구조 단백질인 fibronectin, collagen 그리고 elastin을 포함한 다양한 단백질들을 분해한다. Elastase는 생체 염증 방어의 중요한 성분이며, $\alpha$$_1$-proteinase inhibitor ($\alpha$$_1$PI)와 같은 생체 내부에 있는 단백질 분해 효소 저해제들에 의해 조절된다. 그러나, 만성 염증의 결과, elastase와 $\alpha$$_1$PI 사이의 균형이 elastase 쪽으로 기울어지면 조직 파괴가 일어나게 된다. 본 연구자들은 이미 피부의 진피내에서 백혈구로부터 과다하게 분비되는 elastase를 저해하는 물질을 찾기 위하여, 150 여가지의 한방식물 추출물에 대해 elastase 저해활성을 스크리닝 (screening) 하여, 빈랑 (Areca catecheu) 추출물이 가장 높은 저해활성을 보여줌을 확인하였다. 본 연구에서는 유효성분을 찾기 위하여 빈랑을 90% 에탄올로 추출한 다음, 다양한 용매를 사용하여 분획하였고, 각 분획에 대해 elastase 저해활성을 측정하였다. 이 중 저해 활성이 뛰어난 분획은 silica gel 컬럼 크로마토그래피, Preparative TLC 그리고 역상 HPLC를 실시하였다. 역상 HPLC에서 elastase 저해 활성이 있는 peak은 성분을 확인할 수 있는 여러 가지 정색 반응과 UV, IR 스펙트럼을 통하여 phenol 성 물질임을 확인하였다. 빈랑으로부터 정제한 phenol 성 물질은 돼지 췌장 elastase (Porcine pancreatic elastase : PPE)와 사람 백혈구 elastase (Human neutrophil elastase ; HNE)에 대한 $IC_{50}$/ 값이 각각 26.9 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$과 60.8 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로서, 기존에 elastase의 저해제로 알려진 oleanolic acid (각각 76.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$, 219.2 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)와 ursolic acid (각각 31.0 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$, 118.6 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)에 비하여 더 우수한 저해 활성을 나타내었으며, PPE와 HNE에 대하여 기질과 경쟁적으로 반응함을 알 수 있었다. 또한 빈랑으로부터 정제한 phenol 성 물질이 염증 과정 중에 발생하는 free radical을 소거할 수 있는지를 조사한 결과, free radical을 50% 소거시키는 농도값이 6 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로 표준물질인 비타민 C (19 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)나 butylated hydroxyl toluene (18.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$)보다 우수한 효과를 나타내었다. 그리고 mast cell내에서 활성화되며 hyaluronic acid를 분해하는 hyaluronidase에 대한 저해를 조사한 결과, $IC_{50}$/ 값이 210 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$로서 효과적인 저해 활성을 나타내었다 따라서, 본 연구에서 빈랑으로부터 분리한 phenol 성 물질은 피부 결합 조직을 구성하는 단백질들을 보호함으로써 피부 노화를 억제하는 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
This study evaluates the tyrosinase, elastase inhibitory and antioxidant activities of isolated Lactobacillus rhamnosus fermented extracts of Phragmites communis Trinius. After culture for 4 days at $30^{\circ}C$ using 1% P. communis extract, the cell mass of L. rhamnosus reached $1.4{\times}10^{10}CFU/mL$. The number of cells on P. communis extract and MRS medium was similar. This results indicated that P. communis extract can be used as an economical medium for industrial lactic acid bacteria production. The fermented P. communis extract exhibited 4 fold higher tyrosinase inhibitory effect than non fermented P. communis extract. The non fermented P. communis extract has no inhibitory effect on elastase. However the fermented P. communis extract show high inhibitory effect on elastase ($IC_{50}$; $249{\mu}g/mL$). These results indicated that the fermented P. communis extract can potentially be used for developing new cosmetic or health food ingredients.
To develop a new anti-skin aging cosmetics or functional foods by using antioxidative activity and collagenase inhibitor, a potent collagenase or elastase inhibitor was screened from various extracts of medicinal plants and its optimal extraction condition was investigated. And antioxidative activity, antimicrobial activity and inhibitory of effect against collagenase activity were investigated. In the these results, we selected the Sanguisorba (Sanguisorba officinalis L.) that presents a potential biological activities. Sanguisorba which is very rich in triterpenoid saponin and tannins was recently reported its anti-oxidant activities and phytoestogenic activities in vivo test and many clinical studies. The experiments were carried out in vitro to determine anti-oxidant activities of Sanguisorba extracts on DPPH radical scavenging activity assay, Superoxidase scavenging activity assay, Elastase and collagenase activity assay. It show that the Sanguisorba extracts have the most significant anti-oxidant on free radical scavenging activity assay, and also inhibited significantly activities of elastase, collagenase. Further, Sanguisorba extracts are activated Type I collagen protein expression in CCD-986sk cells. These result suggest that the Sanguisorba extracts on DPPH radical scavenging activity assay, Superoxidase scavenging activity assay, elastase and collagenase activity assay, Type I collagen protein expression in CCD-986sk cells effected could be developed cosmetic ingredients for anti-aging.
이팝나무 꽃으로부터 phenolic 화합물을 추출하기 위하여 열수와 90% 에탄올로 phenolic compounds를 추출하였다. Xanthine oxidase 저해 효과를 측정한 결과, 열수와 에탄올 추출물 $200{\mu}g/mL$ phenolics 농도에서 각각 25.60, 15.92%의 저해 효과를 나타내었다. ${\alpha}$-Glucosidase 저해 효과를 측정한 결과 $200{\mu}g/mL$ phenolics 농도의 에탄올 추출물에서 100.00%의 매우 높은 저해 효과를 나타내었다. 미백효과를 측정하는 tyrosinase 저해 효과를 측정한 결과, 열수와 에탄올 추출물 $200{\mu}g/mL$ phenolics 농도에서 각각 17.27, 36.13%의 저해 효과를 나타내었다. 주름개선 효과를 측정하는 collagenase, elastase 저해 효과를 측정한 결과 에탄올 추출물에서는 $200{\mu}g/mL$ phenolics 농도에서 각각 96.26, 35.93%의 저해 효과를 나타내었다. 항염증 효과를 측정하는 hyaluronidase 저해 효과를 측정한 결과, 열수와 에탄올 추출물 $200{\mu}g/mL$ phenolics 농도에서 각각 36.96, 88.70%의 저해 효과를 나타내었다. 따라서 이팝나무 꽃에서 분리된 phenolic compounds는 $50-200{\mu}g/mL$ phenolics 농도 범위에서 항통풍, 당분해 억제, 미백, 주름개선 및 항염증과 관련된 생리활성 효소를 농도 의존적으로 유의하게 저해하는 것을 확인하였고, 이를 이용한 건강기능성 식품 및 미용식품의 기능성 소재로 활용 가능하다고 판단되었다.
참모자반 분획물은 극성에 따라 핵산, 메탄올, 부탄올 및 수층 순으로 분획하여 4개의 분획층을 얻었으며, 각 분획층의 생리활성을 요약하면 다음과 같다. 항산화 활성은 DPPH radical 소거능과 SOD 활성을 측정한 결과 모두 농도 의존적으로 증가하였으며 특히 메탄올 분획 층에서 가장 높은 항산화 효과를 보였다. 아질산염 소거능 실험에서는 부탄올 층이 pH 1.2에서 57.8%로 4개의 분획물중 가장 높은 아질산염 소거능을 나타냈다. 숙취 해소능을 측정하기 위하여 ADH 활성과 ALDH 활성을 측정하였다. 대조구로 사용한 흡광도 값을 100으로 하였을 때 positive control로 사용한 hepos가 150~167%의 활성을 나타내었으며 4가지 분획층 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하였다. 특히 ALDH에서는 메탄올 분획층이 10 mg/ml 농도에서 167.4%의 활성을 나타내어 hepos와 비슷한 효과를 보였다. 참모자반 분획물의 혈당강하 효과는 ${\alpha}$-glucosidase 활성억제 효과로 측정하였다. ${\alpha}$-glucosidase 활성억제 효과는 핵산 분획층에서 2 mg/ml의 농도에서 94.1%로 아주 높은 항당뇨 효과를 나타내었다. 그런데 부탄올층, 메탄올층 및 수층은 혈당강하효과가 거의 없는 것으로 나타났다. 피부주름예방을 측정하기 위하여 수행한 elastase 저해효과 실험에서 메탄올 분획층에서 농도 의존적으로 높은 주름개선효과가 나타났으며 2 mg/ml 농도에서 93.2%의 효과를 나타냈으며, positive control로 사용한 Vit. C (1 mg/ml) 보다 더 높은 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 모자반 메탄올 추출물 중 특히 메탄올 분획층이 탁월한 주름개선 효과, 숙취 해소능과 항산화 효과가 있는 것으로 사료되며, 핵산층은 혈당강하 효과가 높은 것으로 나타났다. 따라서 모자반 유기용매 분획물은 천연 기능성소재로서의 사용 가능성이 매우 높을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 현재까지 화장품 소재로써 다양한 연구가 진행되지 않은 현지초 추출물의 효능평가 및 항염 관련 활성 연구를 진행하였다. 현지초 추출물의 항산화능을 확인하기 위해 전자공여능 및 ABTS+ 라디칼 소거능을 측정한 결과, 각각 50 ㎍/ml의 농도에서 91%, 94%를 나타내어 항산화능이 우수함을 확인할 수 있었다. 미백활성 측정을 위해 tyrosinase 저해활성 측정을 실시하였으며 최고 농도인 1,000 ㎍/ml에서 24.8%의 저해능이 나타났다. 현지초 추출물의 주름개선 활성을 알아보기 위해 elastase 및 collagenase 저해활성 측정을 실시하였으며 그 결과, 각각 최고 농도인 1,000 ㎍/ml에서 30.6%, 90%의 저해능이 나타났고 collagenase 저해활성에서 우수한 저해능을 확인할 수 있었다. 세포 실험 진행을 위해 현지초 추출물 처리에 따른 대식세포 Raw 264.7의 생존율을 MTT assay에 의거하여 진행하였으며 100 ㎍/ml의 농도에서 83.6% 이상의 세포 생존율을 나타내어 이하의 세포 관련 실험 진행은 100 ㎍/ml 이하의 농도의 현지초 추출물을 가하여 실험을 실시하였다. NO assay에 의하여 현지초 추출물 처리에 따른 NO 생성 저해 활성을 측정한 결과, 100 ㎍/ml의 농도에서 74.9%의 저해율을 확인하였다. 단백질 발현 억제능을 알아보기 위해 western blot을 진행하였으며 현지초 추출물은 COX-2 및 iNOS 두 인자 모두 농도의존적으로 단백질 발현량이 저해됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들에 의해 현지초 추출물은 항염 관련 기능성 화장품 소재로써 활용 가능성이 있다고 사료된다.
골담초에 함유된 페놀성 물질은 70% 에탄올을 용매로 하여 18시간 추출하였을 때 가장 많이 용출되었다. 항산화 효과 중 전자공여능을 측정한 결과는 꽃과 잎 모두 70% 에탄올 추출물에서 74%로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었으며, ABTS radical cation decolorization을 측정한 결과, 꽃의 경우 70~90% 에탄올 추출물에서 60% 이상의 항산화 활성을 나타내었다. 지용성 물질에 대한 항산화력으로 antioxidant protection factor(PF)를 측정한 결과, 70% 에탄올 추출물에서 1.2 이상의 PF를 나타내었다. 활성산소 중 지방산화를 일으키는 hydroxyl radical에 대한 골담초 추출물의 영향은 꽃의 물 추출물과 70% 에탄올 추출물에서 대조구보다 낮은 TBARS 값을 나타내었다. ACE에 대한 골담초 추출물의 저해활성은 꽃의 경우 물과 70% 에탄올 추출물 모두 80~99%의 높은 저해활성을 나타내었고, Xoase 대한 저해활성은 꽃보다 잎 추출물의 저해활성이 높았다. 골담초 추출물의 주름개선과 미백효과를 확인한 결과 꽃과 잎 추출물 모두 페놀성 물질을 0.8 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 50% 이상의 elastase 저해활성과 70% 에탄올 추출물에서 40.24%로 가장 높은 tyrosinase 저해활성을 나타내었고, 수렴효과는 같은 농도의 tannic acid보다 높은 수렴효과를 나타내었다.
해조류 매생이의 기능성을 증명하기 위하여 열수 또는 에탄올 추출하여 여러 가지 생리활성에 대하여 조사하였다. 우선, 매생이 열수와 에탄올 추출물의 항산화능을 조사하기 위하여 DPPH radical 소거능, SOD 유사활성을 측정하였다. 그 결과, 매생이 열수와 에탄올 추출물의 농도가 증가함에도 불구하고 낮은 증가율을 보였는데, 10 mg/ml에서 DPPH radical 소거능은 각각 10.8, 62.4%, SOD 유사활성은 각각 13.8, 27.1%로 나타났다. 항고혈압 활성 측정에서는 1 mg/ml의 매생이 열수와 에탄올 추출물이 각각 5.9, 49.7%의 활성을 보여 비교적 높은 효능이 매생이 에탄올 추출물에서 나타났다. 매생이 열수와 에탄올 추출물의 혈당 강하 효과는 ${\alpha}$-glucosidase 저해능 분석으로 측정하였는데, 1 mg/ml 농도의 매생이 열수와 에탄올 추출물은 각각 1.4, 67.3%로써 비교적 높은 효능을 매생이 에탄올 추출물에서 보였다. 매생이의 숙취해소 효능은 ADH와 ALDH 활성증진에 매생이 열수와 에탄올 추출물이 미치는 영향을 조사함으로써 증명하고자 하였다. 그 결과, 매생이 열수와 에탄올 추출물의 농도가 증가함에도 불구하고 알콜 분해능 증가율이 낮게 나타났으며, 심지어 acetaldehyde 분해능은 관찰되지 않았다. Elastase 억제 효능 분석에서는 매생이 열수와 에탄올 추출물 10 mg/ml에서 각각 75.9, 51.2%로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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