• 문화기술의 융합
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• 제9권1호
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• pp.717-724
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• 2023

사플라워와 마더워트 등 에탄올복합추출물(SEC)을 lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포와 마우스 폐포 대식세포주인 MH-S 세포에서 사플라워와 마더워트 등 에탄올복합추출물((SEC)의 항균과 항염증 활성 효과를 조사하였다. 그 결과 SEC(500 ㎍/mL)의 전처리 LPS 자극 세포에서 iNOS 단백질 및 염증성 사이토카인 mRNA 발현을 크게 억제하였다. 사플라워와 마더워트 등 에탄올복합추출물(SEC)에 의한 항염증활성 효과는 다음과 같이 관찰되었다. 사플라워와 마더워트 등 에탄올복합추출물(SEC)은 IκB-α 인산화의 억제를 통해 시토졸에서 핵으로의 NF-κB의 전좌를 억제하고 또한 LPS로 자극된 NF-κB 전사 활성을 억제하였다. 이러한 결과는 사플라워와 마더워트 등 에탄올복합추출물(SEC)이 항염증 작용을 발휘 하고 사플라워와 마더워트 등 에탄올복합추출물(SEC)의 잠재적인 치료 가치성 및 기본 메커니즘을 규명 할 수 있었다. 결론적으로 사플라워와 마더워트 등 에탄올복합추출물(GRP)이 다양한 항염증 활성성분 함유 및 천연 항염증제의 잠재적 공급원으로 활용 가능성이 있음을 시사 하였다.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제27권4호
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• pp.417-426
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• 2023

The TRPM4 gene encodes a Ca²⁺-activated monovalent cation channel called transient receptor potential melastatin 4 (TRPM4) that is expressed in various tissues. Dysregulation or abnormal expression of TRPM4 has been linked to a range of diseases. We introduced the hemagglutinin (HA) tag into the extracellular S6 loop of TRPM4, resulting in an HA-tagged version called TRPM4-HA. This TRPM4-HA was developed to investigate the purification, localization, and function of TRPM4 in different physiological and pathological conditions. TRPM4-HA was successfully expressed in the intact cell membrane and exhibited similar electrophysiological properties, such as the current-voltage relationship, rapid desensitization, and current size, compared to the wild-type TRPM4. The presence of the TRPM4 inhibitor 9-phenanthrol did not affect these properties. Furthermore, a wound-healing assay showed that TRPM4-HA induced cell proliferation and migration, similar to the native TRPM4. Co-expression of protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 6 (PTPN6 or SHP1) with TRPM4-HA led to the translocation of TRPM4-HA to the cytosol. To investigate the interaction between PTPN6 and tyrosine residues of TRPM4 in enhancing channel activity, we generated four mutants in which tyrosine (Y) residues were substituted with phenylalanine (F) at the N-terminus of TRPM4. The YF mutants displayed properties and functions similar to TRPM4-HA, except for the Y256F mutant, which showed resistance to 9-phenanthrol, suggesting that Y256 may be involved in the binding site for 9-phenanthrol. Overall, the creation of HA-tagged TRPM4 provides researchers with a valuable tool to study the role of TRPM4 in different conditions and its potential interactions with other proteins, such as PTPN6.

• Molecules and Cells
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• 제46권9호
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• pp.545-557
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• 2023

Sphingomyelinase (SMase) catalyzes ceramide production from sphingomyelin. Ceramides are critical in cellular responses such as apoptosis. They enhance mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) through self-assembly in the mitochondrial outer membrane to form channels that release cytochrome c from intermembrane space (IMS) into the cytosol, triggering caspase-9 activation. However, the SMase involved in MOMP is yet to be identified. Here, we identified a mitochondrial Mg²⁺-independent SMase (mt-iSMase) from rat brain, which was purified 6,130-fold using a Percoll gradient, pulled down with biotinylated sphingomyelin, and subjected to Mono Q anion exchange. A single peak of mt-iSMase activity was eluted at a molecular mass of approximately 65 kDa using Superose 6 gel filtration. The purified enzyme showed optimal activity at pH of 6.5 and was inhibited by dithiothreitol and Mg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, and Fe³⁺ ions. It was also inhibited by GW4869, which is a non-competitive inhibitor of Mg²⁺-dependent neutral SMase 2 (encoded by SMPD3), that protects against cytochrome c release-mediated cell death. Subfractionation experiments showed that mt-iSMase localizes in the IMS of the mitochondria, implying that mt-iSMase may play a critical role in generating ceramides for MOMP, cytochrome c release, and apoptosis. These data suggest that the purified enzyme in this study is a novel SMase.

• 생명과학회지
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• 제33권11호
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• pp.851-858
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• 2023

Unique cartilage matrix-associated protein (UCMA)은 γ-카르복실화(Gla) 잔기가 풍부한 간외 비타민 K 의존 단백질이다. UCMA는 조골세포 분화를 촉진하고 뼈 형성을 강화한다고 보고되고 있지만 고혈당 스트레스 하에서 조골세포에 미치는 영향에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 고혈당 조건하에서의 MC3T3-E1 조골세포에서 UCMA 효과를 조사하기 위해 MC3T3-E1 조골세포를 높은 포도당에 노출한 후 재조합 UCMA 단백질을 처리하였다. MC3T3-E1 세포에서 활성 산소종(ROS)의 생성은 고혈당 조건하에서 증가했으나 UCMA 단백질 처리 후 감소했음을 CellROX 및 MitoSOX 염색으로 확인하였다. 또한 고혈당 조건에서 UCMA 단백질을 함께 처리한 MC3T3-E1 세포에서 정량적 중합효소 연쇄반응 결과, 항산화 유전자인 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 와 superoxide dismutase 1 발현이 증가하였다. 동일 조건하에서 UCMA 단백질 처리에 의해 heme oxygenase-1 발현 감소와 함께 세포질에서 핵으로의 전위가 감소되었고, 미토콘드리아 분열에 관여하는 dynamin-related protein 1 발현이 증가하였으며, AKT 신호 활성은 억제되었다. 종합적으로 UCMA는 고혈당에 노출된 조골세포에서 ROS 생성을 완화하고, 항산화 유전자 발현을 증가시키고, 미토콘드리아 역학에 영향을 미치며, AKT 신호를 조절하는 것으로 보인다. 본 연구는 UCMA의 세포 메커니즘에 대한 이해를 돕고, 대사 장애 관련한 골 합병증에 대한 새로운 치료제로서의 잠재적 사용 가능성을 제시하고 있다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제38권5호
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• pp.305-310
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• 2023

본 연구는 OECD TG No. 458, 22Rv1/MMTV_GR-KO 전사 활성화 분석법을 포함한 세포 기반 분석법을 사용하여 식품 및 생활용품에 포함된 파라벤과 트리클로산의 인간 안드로겐 수용체를 매개하는 내분비계 교란 가능성을 확인하는 것을 목표로 한다. 4가지 파라벤(메틸-, 에틸-, 프로필-, 부틸-)은 OECD TG No.458에서 AR 길항제로 확인된 반면, 파라벤의 AR 길항 효과는 S9 간 분획물이 있는 경우 나타나지 않았다. 트리클로산 역시 AR 길항제로 분류되었으며, 트리클로산에 의해 유도된 AR 길항 효과는 S9 간 분획물이 존재할 때 제 1상+2상 대사에서 유의하게 감소되었다. 파라벤과 트리클로산에 의해 유도되는 AR 길항 기전은 세포질 내 AR 이량화를 차단하여, 리간드 결합 AR이 핵으로의 전위를 억제함으로써 AR 매개 내분비 교란 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 4가지 파라벤과 트리클로산이 AR 이량화 저해를 통한 AR 길항 효과를 나타내는 AR 매개 내분비 교란 가능성을 가지고 있으나, 간 대사 효소가 존재할 경우 내분비 교란 효과는 감소됨을 시사한다.

• Biomolecules & Therapeutics
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• 제32권3호
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• pp.329-340
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• 2024

Mangiferin is a kind of natural xanthone glycosides and is known to have various pharmacological activities. However, since the beneficial efficacy of this compound has not been reported in retinal pigment epithelial (RPE) cells, this study aimed to evaluate whether mangiferin could protect human RPE ARPE-19 cells from oxidative injury mimicked by hydrogen peroxide (H₂O₂). The results showed that mangiferin attenuated H₂O₂-induced cell viability reduction and DNA damage, while inhibiting reactive oxygen species (ROS) production and preserving diminished glutathione (GSH). Mangiferin also antagonized H₂O₂-induced inhibition of the expression and activity of antioxidant enzymes such as manganese superoxide dismutase and GSH peroxidase, which was associated with inhibition of mitochondrial ROS production. In addition, mangiferin protected ARPE-19 cells from H₂O₂-induced apoptosis by increasing the Bcl-2/Bax ratio, decreasing caspase-3 activation, and blocking poly(ADP-ribose) polymerase cleavage. Moreover, mangiferin suppressed the release of cytochrome c into the cytosol, which was achieved by interfering with mitochondrial membrane disruption. Furthermore, mangiferin increased the expression and activity of heme oxygenase-1 (HO-1) and nuclear factor-erythroid-2 related factor 2 (Nrf2). However, the inhibition of ROS production, cytoprotective and anti-apoptotic effects of mangiferin were significantly attenuated by the HO-1 inhibitor, indicating that mangiferin promoted Nrf2-mediated HO-1 activity to prevent ARPE-19 cells from oxidative injury. The results of this study suggest that mangiferin, as an Nrf2 activator, has potent ROS scavenging activity and may have the potential to protect oxidative stress-mediated ocular diseases.

• 생명과학회지
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• 제21권10호
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• pp.1377-1384
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• 2011

Astaxanthin (ATX)은 다양한 생명체에서 생성되는 카로티노이드 색소이다. 본 연구에서는 ATX가 RAW264.7 cell에서 LPS에 의한 inducible nitric oxide synthase (iNOS), nitric oxide (NO), 염증성 사이토카인, nuclear factor-kappa B (NF-${\kappa}B$)와 reactive oxygen species (ROS)의 생성을 억제 시키는 지 또한, superoxide radical 소거능이 있는 지를 조사하였다. iNOS와 NF-${\kappa}B$는 immunoblot analysis로, interleukin (IL)-6와 tumour necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$)는 ELISA 법으로 분석하였다. NO 양은 nitrite의 양을 측정하였고, ROS는 2',7'-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) 법으로 superoxide radical 소거능은 superoxide radical scavenging activity assay로 검증하였다. 100 ${\mu}M$의 ATX 농도에서 LPS로 유도된 NO, IL-6 및 TNF-${\alpha}$ 같은 염증성 사이토카인의 생성 뿐만 아니라 iNOS 및 NF-${\kappa}B$의 발현도 억제되었다. 특히, IL-6 및 TNF-${\alpha}$ 생성에 있어 ATX의 최대 억제율은 각각 65.2% 및 21.2% 이었으며 LPS로 유도된 NF-${\kappa}B$의 전사활성을 억제하였다. 이러한 현상은 세포질에서 핵으로 NF-${\kappa}B$의 전위를 억제하는 것과 관련이 있다. 또한, 25-100 ${\mu}M$의 ATX 농도에서 세포 내 ROS 생성을 억제하였으며, 5 mg/ml 농도의 ATX는 동일농도의 ${\alpha}$-tocopherol에 비해 superoxide radical 소거능이 1.33배 높았다. 이러한 결과들은 ATX가 대식세포에서 ROS 생성 및 NF-${\kappa}B$ 활성을 저해하므로 iNOS의 발현, NO 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하며, 또한 우수한 superoxide radical 소거능을 보유한다는 것을 나타내었다. 결론적으로, ATX가 항염증제 및 항산화제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제22권2호
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• pp.209-219
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• 2012

눈조직의 젖산탈수소효소(LDH, EC 1.1.1.27) eye-specific $C_4$ 동위효소의 특성을 native-PAGE, Western blotting, 면역침강반응 및 효소 역학을 이용하여 연구하였고, LDH eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성을 측정하는 조건을 제시하였다. 파랑볼우럭(Lepomis macrochirus)과 큰입우럭(Micropterus salmoides) 눈조직의 세포기질에서 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소가 확인되었으며 $B_4$ 동위효소보다 $A_4$ 동위효소에 유사하였다. 파랑볼우럭 눈조직의 LDH/CS는 9월에 증가하여 혐기적 대사가 높게 이루어졌다. 파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직 미토콘드리아 LDH의 전기영동상은 세포기질 LDH와 유사하였다. 눈조직의 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소는 Preparative native-PAGE에 의해 정제되었다. 파랑볼우럭과 큰입우럭의 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성은 피루브산 0.2 mM과 0.1 mM 이상의 농도에서 각각 감소되었고, 피루브산 10 mM에서 5.2%, 15.8% 활성이 남아 저해 정도가 크게 나타났다. 그리고 눈조직의 LDH 활성도 젖산 22 mM과 24 mM 이상의 농도에서 각각 감소되어졌다. 파랑 볼우럭 eye-specific $C_4$ 동위효소의 $Km^{PYR}$는 0.088 mM, 큰입우럭 eye-specific $C_4$ $Km^{PYR}$는 0.033 mM였으며, 세포기질과 미토콘드리아 eye-specific $C_4$ 동위효소는 ${\alpha}$-ketobutyric acid에서 활성이 높게 나타났다. 눈조직과 eye-specific $C_4$ 동위효소의 활성은 피루브산 0.5 mM과 Tris-HCl 완충액, pH 7.5에서 측정하는 것이 적합한 것으로 확인되었다. 실험 결과, 큰입우럭 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소는 파랑볼우럭 LDH eye-specific $C_4$보다 피루브산에 대한 친화력이 큰 것으로 확인되었고, 더 낮은 피루브산의 농도에서 최대 활성에 이르고, 더 높은 젖산의 농도에서 최대 활성을 나타냈다. 따라서 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소에 의해 생성된 에너지가 포식 행동의 초기 반응에 사용되는 것으로 사료된다.

• Applied Microscopy
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• 제30권4호
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• pp.357-365
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• 2000

포유류 장생 상피세포의 하나인 파네스세포(Paneth cell)는 여러 가지 금속류를 함유하고 있으며, 생체가 과잉의 이들 금속류에 노출되거나 부족할 때에 장 내강을 통해 제거하거나 흡수함으로써 금속류의 항상성에 기여한다고 알려져 있다. 이번 연구는 이러한 연구보고에 근거하여 금속류중에서 zinc를 실험적으로 과량투여한 후 파네스세포내 zinc의 분포에 어떤 변화가 초래되는 지를 광학 및 전자현미경적 autometallography(AMG)로 관찰함으로써 파네스세포의 zinc와 관련된 세포생물학적 기능을 규명하고자 하였다. Wistar 랫드에 체중 당 20mg의 zinc chloride를 생리식염수 5ml에 녹여 복강주사한 후 2시간에 이르러 0.1 M phosphate buffer(PB)에 녹인 0.5% sodium sulphide-3% glutaraldehyde 흔합액으로 관류고정하였다. 회장(ileum)의 일부를 Dry Ice나 $CO_2$ gas로 얼린 후 cryostat을 이용하여 $20{\mu}m$ 두께의 조직절편을 만들어 및 단계의 AMG법을 시행하였다. 이와는 별도로 EM용으로 선택된 회장절편은 일련의 전자현미경 표본제작과정을 거쳐, 100nm두께의 thin section을 만들어 uranyl-lead 이중염 색 추 전자현미경으로 관찰하였다. Zinc를 투여한 동물에서 관찰된 소견은 생리식염수만을 투여한 대조군의 것과 비교할 때 큰 차이를 보였다. 우선 대조군에서는 파네스세포의 꼭대기(apex)부위에서 낱알모양을 띤 AMG양성반응 구조물(AMG grain)들이 분비과립과 사이토졸(cytosol)에서 관찰되었고, 세포사이공간에서도 적은 양의 grain이 분포하고 있었다. 반면 zinc를 투여한 랫드의 파네스세포에서는 AMG 입자가 이상의 부위에서 훨씬 많은 양의 grain이 분포해 있었으며, 특히 분비과립에서는 가장 높은 농도로 관찰되었다. 더욱이 대조군에서 관찰되지 많았던 장샘의 분비관(Lieberkuhn crypt)및 고유판 혈관의 내에서도 많은 grain이 관찰되었다. 이상의 결과를 요약하면 과량의 zinc에 노출된 생체는 혈관을 경유하여, 파네스세포의 분비과립을 매개로 하여, 장관의 내강쪽으로 과잉의 zinc 를 피내고 있는 모습을 보인다. 따라서 연구자는 파네스세포가 생체내 zinc의 양을 조절하는데 중요한 역할이 있을 것으로 본다.

• Applied Microscopy
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• 제18권2호
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• pp.1-20
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• 1988

The species of the slug used in the experiment is Limax flavus L. For identifying the chemical characteristics of the epidermis, granules and mucus-producing cell of this animal is examined with methylene blue-basic fuchsin double stain and PAS-alcian blue reagent. For the ultrastructural research of the epidermal free surface, the epitheial cell and the parenchymal cell are used with scanning electron microscope and transmission elec-tron microscope respectively. I . Epidermal tissue The epidermal tissue of the slug is observed being divided into the dorsal and the ventral side(toot pad) respectively. 1) Dorsal epidermal tissue The dorsal epidermis of the slug is constituted with the simple columnar epithelium and the microvilli are compacted on the epidermal free surface. Two different types of the secretory granules of the neutral and the acid mucus are observed between the epithelial cells, and the neutral mucous granules are highest electron-dense but the acid mucous granules are observed to be electron-lucent. 2) Foot epidermal tissue The Foot epidermis is formed with the taller simple columnar epithelium than the dorsal epidermis and these cells have both a large number of the microvilli and a few number of the large villi. The secretory granules of three different types, which are acid, neutral and mixed mucous granule of two different types are observed between the epithelial cells. The neutral mucous granules are highest electron dense but the acid mucous granules are observed to be electron-lucent. II . Mucous granule-producing cell and mucus-producing cells Seven different types of the granules-producing cell and the mucus-producing cells are observed between the parenchyma. 1) A-type of acid mucous granule-producing cell The electron-lucent granules are largely occupied in the cytoplasm of these cells and then the granules are surrounded by irregular membrane. These electron-lucent granules exhibit alcianophilia with PAS-alcian blue reaction, so these granules are certified to be acid mucopolysaccharide. 2) B-type of acid mucus-producing cell The nucleus and the cytoplasm of these cells are pushed by the acid mucus of the electron-lucent toward the cell membrane. This mucus has been confirmed to be the acid mucopolysaccharide with PAS-alcian blue reagent. 3) A-type of neutral mucous granule-producing cell These cells contain the electron-dense round granules with approximately $1{\mu}m$ in diameter, which exhibit strongly PAS-positive reaction. These granules are confirmed to be the neutral mucoplysaccharide. 4) B-type of neutral mucous granule-producing cell These cells contain two different types of electron dense granules and electron-lucent granules; The former exhibits to be strongly PAS-positive and the latter to have alcianophilia reaction respectively. 5) C-type of neutral mucus-producing cell These cells are similar to the shape and the size of the B-type of mucus-producing cell but these two different types of cells are stained with reversing properties to each other. The mucus of the C-type cell that electron-lucent is largely occupied in the cytoplasm that exhibits strongly PAS-positive reaction. 6) D-type of neutral mucous granule-producing cell These cells contain round granules about $1{\mu}m$ in size which are observed to be medium electron-dense granules and those granules are stained brightly red with PAS-weak positive reaction. The granules are certified to be neutral mucopolysaccharide. 7) E-type of neutral mucous granule-producing cell These cells are similar to the shape and the size of the D-type of neutral mucous granule-producing cell. These cells contain a large number of granules with about $1{\mu}m$ in diameter showing electron-lucent and then granules are seen to be PAS-weak positive reaction. III. Parenchyma The clear cell and dark cell are found in the parenchyma of the Limax flavus L. 1) Clear cell These cells are round formed and the nucleus of the cells are larger than cytoplasm. These cells which have the electron-lucent cytosol possess poorly developed organelles. 2) Dark cell These cells are found to be dark cells due to high electron-density, which exhibit strongly methylene-blue reaction from double stain of methylene blue-basic fuchsin.