온전한 접합자배 또는 자엽절편을 오옥신(2,4-D, IAA)과 사이토카이닌(BA, kinetin)이 첨가된 배지에 배양하였다. 접합자배를 온전한 상태로 배양했을 경우, 오옥신은 발아를 억제하였으나 사이토카이닌은 억제하지 않았고, 체세포배의 발생은 발아되지 못하는 배에서만 유도되었다. 자엽절편을 배양한 경우, 기본배지에서 체세포배발생률이 가장 높았다. 오옥신을 첨가한 배지에서는 체세포배가 자엽의 표면에서 산재하여 발생되었는데 비해서 기본배지에서는 자엽의 기부에서만 발생되었다. 2,4-D를 첨가한 배지에서는 체세포배가 자엽의 표피 및 하표피를 포함한 다수의 세포로부터 기원되어 다배로 발생되었다. 이 체세포배를 같은 배지에 배양했을 때 일차배의 표면으로부터 이차배가 발생되었는데 이들의 경우는 주로 표피 또는 하표피의 단세포로부터 유래되었음을 조직학적으로 밝혔다.
Shoot induction system was developed in the recalcitrant plant species, Brassica rapa ssp. rapifera by using optimum selection of profit organ, phytohormone combination, seedling age and kind of culture container. Out of in vitro cultured leaf segment, petiole, hypocotyl, and cotyledon with petiole, only cotyledon with petiole derived from 4 day-old seedlings induced multiple shoot. The optimum combination of auxin and cytokinin for the multiple shoot induction was MS medium containing 5mg/L BA and 0.5mg/L NAA. The major factors for multiple shoot propagation were part of plant organ, age of seedling, and ratio of auxin and cytokinin. In addition, shoot regeneration was promoted in the 100ml Erlenmeyer flask compared with the $90mm{\times}20mm$ Petri-dish. The induced shoots formed roots easy on MS medium containing 0.1mg/L IBA and the whole plants were successfully cultivated in soil.
A specific deleted version of ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR1 (ARR1) lacking the signal receiver domain (1.152 amino acids)-coding sequence, referred to as $ARR1{\Delta}DDK$, was amplified using Arabidopsis thaliana cDNA prepared from adult leaves and transferred into the genome of Nicotiana tabacum cv. Samsun under the transcriptional control of a ${\beta}$-estradiol-inducible expression system. The ectopic expression of $ARR1{\Delta}DDK$ affected the morphology of transgenic seedlings and their segments in vitro. In the presence of an inducer, ${\beta}$-estradiol, ectopic expression of $ARR1{\Delta}DDK$ induced only the formation of soft, pseudo-bulbous tissue in the root tip region of intact seedlings, which appeared similar to callus generated on a hypocotyl segment in the presence of 2,4-D and 6-benzyladenine (BA), both at $1\;{\mu}M$. Those callus tissues on the root tip region could not generate shoots unless $1\;{\mu}M$ BA was supplied. In segment culture, ectopic expression of $ARR1{\Delta}DDK$ induced calluslike tissue around the cut-end of cotyledon and hypocotyl segments with occasional shoot formation, suggesting that the expression of $ARR1{\Delta}DDK$ could substitute for the effects of cytokinin on these segments. Additionally, treatment with only ${\beta}$-estradiol induced NtWUS, a WUS ortholog in tobacco, which was detected during the process of callus tissue formation in the root tip region and also in cotyledon or hypocotyl segments. These findings suggest that the NtWUS might be associated in the transdifferentiation process caused by the functional regulation of $ARR1{\Delta}DDK$ in transgenic tobacco seedlings.
최근 국내에서 연구가 시작되고 있는 신규 식물생장조정제인 brassinolide류와 기존의 auxin류를 혼용하였을 경우 상호작용성을 구명하여 농업적 이용의 기초자료를 얻고자 몇가지 생물검정법을 이용하여 상호작용의 결과를 분석해 본 결과를 요약하면 다음과 간다. 1. 벼 엽신기부굴절검정에서는 두 화합물의 저농도 혼용조합에서 길항적인 반응을 보였으나, 대부분의 조합에서는 상가 또는 상승작용을 하였으며, 고농도의 혼용일수록 상승효과가 높았고, IAA가 2, 4-D에 비해 다소 혼용효과가 높았다. 2. 귀리 자엽소신장검정에서는 HBR의 농도에 관계없이 IAA 0.1ppm 이하에서는 상승작용을 하였으나 0.3ppm 이상의 혼용에서는 상가적인 반응을 나타내었다. 3. 무 하배축신장검정에서는 자엽의 유무에 의해 반응이 다르게 나타났는데, 자엽을 제거한 절편에서는 IAA 3ppm과 HBR과의 혼용조합을 제외하고는 대부분의 혼용조합이 길항적인 반응을 보였다. 4. 이상에서와 같이 검정방법간 혼용효과가 뚜렷한 차이가 있었으며, 공시재료에 따라 상호작용의 효과가 다르게 나타났는데 auxin의 함량이 비교적 높은 생장점을 가진 절편에서는 대체로 길항작용을 보인 반면, 선단부를 제거하여 내생호르몬이 불안정한 절편에서는 상가 또는 상승작용을 보였다.
인삼 접합자배의 자엽을 식물호르몬이 전혀 첨가되지 않은 MS기본배지에 배양한 결과 자엽의 기부에서 높은 빈도의 체세포배가 유기되었다. 체세포배의 형성 빈도는 접합자배 자엽의 성숙도에 따라서 차이가 있었는데 미숙배에서 성숙배로 진행됨에 따라 감소되는 경향을 보였다. 미숙자엽의 경우에는 표피세포의 윗 아래층들이 모두 성숙자엽의 세포보다 더 적거나 더 촘촘하였으며, 많은 세포들이 체세포배의 형성에 관여하였으나 뿌리의 형성이 어려운 다배상태로 유기되었다. 그러나 발아직적의 성숙자엽은 표피세포의 윗층만이 촘촘한 세포로 이루워 졌으며 뿌리의 형성이 가능한 체세포 단일배로 유기되었다. 이런 결과는 체세포배의 기원과 발육이 배발생시 사용한 자엽의 성숙도에 따라서 배발생에 관여한 세포들이 단일 혹은 다량상태인지에 따라서 결정된다는 것을 의미한다.
배발생 캘러스의 선발은 1.0mg/L 2,4-D를 첨가한 MS 기본배지에서 배양한 당근 유식물의 배축절편으로부터 유도된 캘러스에서 이뤄졌다. 체세포배 발생을 유도하기 위해서 배발생 캘러스로부터 얻어진 세포괴는 2,4-D를 제거한 MS 배지에 옮겼다. 세포괴를 1.0mg/L 2,4-D 첨가배지에서 1주간 그리고 2,4-D 제거 배지에서 2주간 배양한 후에 2자엽배의 발생은 63%에 그쳤고 나머지는 1자엽 5%, 3자엽 21%, 4자엽 6%, 5자엽 5%, 6자엽 0.2% 및 나팔형 자엽 1%의 발생빈도를 나타냈다. 체세포배의 발아율은 다자엽 체세포배에서 보다 2자엽 배에서 높았다. 나팔형 자엽의 체세포배는 경엽부 발생없이 자엽과 뿌리가 다소 신장 확대되는데 그치는 등 정상적으로 발아되지 못했다. 해부학적인 관찰에서 체세포배의 뿌리와 환상 전형성층은 배축의 중간부위에서 분지되기 시작하고 자엽절을 거쳐서 자엽으로 이어지는데 배축에서 전형성층속은 자엽수와 같은 수였다. 1자엽 체세포배는 다자엽 체세포배의 각각의 자엽보다 크고 전형성층과 함께 말굽형 자엽을 가지고 있었다. 따라서 체세포배의 자엽구조는 전형성층 배열상태와 밀접한 관련이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
땅두릅에 있어서 이상체세포배의 형성에 미치는 ABA의 영향을 구명하기위하여 체세포배는 1.0 mg/L 2,4-D가 첨가된 M 기본배지상에서 자엽유래 배발생 세포괴로부터 유도되었다. 배발생세포괴에 0.2 mg/L의 ABA를 처리하여 3주간 배양한 후 ABA가 첨가되지않은 기본배지에 2주간 계속 배양한 경우에 2개의 정상적인 자엽수를 갖는 배는 68%. 생장조절물질이 첨가되지않은 MS 기본배지에 5주간 배양한 대조구에(59.4%) 비하여 높게 나타났다. 그러나 0.2mg/L의 ABA를 처리하여 3주간 배양한 후 ABA의 농도를 0.1 mg/L로 반감한 배지에서 2주간 배양한 경우에는 정상의 자엽을 갖는 배는 28.6%로 감소된 반면에 3개 이상의 자엽을 갖는 다자엽배의 형성률이 높게 나타났다. 구형배에 ABA를 농도별(0.01-1.0 mg/L)로 처리한 경우에 정상의 자엽을 갖는 배의 형성률은 농도에 비례하여 감소되었으며, 다자엽배의 형성률은 높게 나타났다. 또한 심장형, 어뢰형 및 자엽시기 등 배발생 단계별로 배에 ABA를 각각 상기와 같이 단기간 처리하거나 계속처리한 경우에도 다자엽배의 형성률은 높게 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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