• KSBB Journal
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• 제14권3호
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• pp.322-327
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• 1999

토양에서 분리된 Streptomyces sp으로부터 cholesterol oxidase의 정제 및 효소학적 특성을 조사하였다. 본 효소의 정제는 50~80% 포화의 황산암모늄 침전 및 cholesterol affinity column chromatography를 통하여 28.3%의 수율로 정제 되었다. 정제된 효소는 SDS-PAGE에서 단일한 밴드를 보였으며 분저량은 약 60,000 dalton으로 추정되었으며, HPLC분석 결과 단일의 peak로 검출되었다. 본 효소의 특성을 검토한 결과, 금속 이온으로 Hg와 Cu의 존재시 크게 저해를 받았고, dithiothreitol 과 mercaptoethanol과 같은 저해제에 의해서 상당히 실활되었다. 본 cholesterol oxidase의 Michaelis 상수는 cholesterol을 기질로하여 Lineweaver-Burk plot분석에서 1.38mM로 추산되었다. 정제효소의 아미노산 조정은 약 416개의 잔기로 추정되며 glycine, alanine, threonine의 함량이 높은 반면, methionine, isoleucine의 함량은 극히 낮았다.

• KSBB Journal
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• 제13권2호
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• pp.195-202
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• 1998

Rhodococcus sp. 3T6-5Mj 균주의 배양액으로부터 0.2${\mu}m$ membrane filter을 통과시키고, 아세톤 침전, DEAE-Sephadex A-50 column chromatography의 약음이온 교환수지,cholesterol affinity column chromatography를 통과시켜서 콜레스테롤 산화 효소를 25.6units/mg의 비활성도, 15%의 회수율,88배로 정제할 수 있었다. 본 균주가 생산하는 콜레스테롤산화효소의 분자량은 SDS-PAGE로 측정한 결과 약,52,000 daltons 정도로 추정되었다. 그리고 이 효소의 Km값은 콜레스테롤을 기질로 측정하였을 때 $3.2{\times}10^{-4}M$ 이었다. 본 효소의 최적온도는 $50^{\circ}C$최적 pH는 7.0으로 나타났으며, 열에 대한 안정성은 30~$45^{\circ}C$,pH에 대한 안정성은 6.5~11.0으로 나타났다. 본 효소는 cholesterol, campesterol, stigmasterol, hecogenin, $\beta$m-sistosterol의 기질에 특이성을 나타내었다. 본 효소의 아미노산 440개의 잔기로 이루어져 있으며,그 아미노산 조성은 aspararine/aspartate > glutamine/glutamate > proline > alaline > histidine 의 순으로 나타났다. 본 효소는 효소적 혈중 콜레스테롤의 측정방법에 필수적인 콜레스테롤 산화 효소의 이용 가능성을 보여 주었다.용 가능성을 보여 주었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권2호
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• pp.142-150
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• 2002

Cholesterol oxidase(EC 1.1.3.6)는 cholesterol을 산화 또는 이성화시키는 효소로, 혈중 cholesterol 측정 등의 임상진단용 시약에 이용되고 있으며, 여러 종류의 미생물에서 분리, 연구되어 왔다. 현재에는 농업 및 식품 등에도 응용이 기대되고 있는 매우 유용한 효소이다. 본 실험은 공시균인 Streptomyces polychromogenes IFO 13072의 효소 생산 조건과 cholesterol oxidase의 정제 및 효소학적 특성을 조사하였다. 효소 생산 조건을 검토한 결과, 탄소원으로 1% dextrin, 유기 질소원으로는 0.5% casamino acid, 무기 질소원으로는 0.5% sodium nitrate가 효소생산에 우수하였으며, 이들 탄소원, 질소원 이외 0.1% $KH_2$$PO_4$, 0.05% $MgSO_4$ㆍ$7H_2$O가 함유된 배지를 생산 최적 배지로 사용하였다. 본 효소의 정제는 30-80% 포화의 ($NH_4$)$_2$$SO_4$ 침전 및 cholesterol affinity column chromatography를 통하여 23.2%의 수율로 정제되었다. 정제된 효소는 SDS-PAGE에서 단일한 밴드를 보였으며, 분자량은 약 52,000 Da으로 추정되었다. 본 효소의 특성을 검토한 결과, 최적 온도와 최적 pH는 각각 $37^{\circ}C$, pH 7.0이었으며, 효소의 안정성은 온도 $25^{\circ}C$, pH 6.0~7.0의 범위까지 안정한 것으로 나타났다. 또한 본 효소는 금속이온으로 Hg와 Fe 이온의 존재시 크게 저해를 받았고, dithiothreitol과 mercaptoethanol, Isonicotinic acid와 같은 저해제에 의해서 상당히 실활 되었다. 본 cholesterol oxidase의 Michaelis 상수는 cholesterol을 기질로 하여 Lineweaver-Burk plot 분석에서 25 mM로 추산되었다

• 생명과학회지
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• 제28권1호
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• pp.99-104
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• 2018

Streptococcus pneumoniae는 pneumolysin과 같은 병원성 인자를 가지고 있으며, 지역사회에서 전파되는 심각한 병원성균에 포함된다. Pneumolysin (PLY)은 콜레스테롤 의존적으로 세포막에 구멍을 형성하는 세포독소로서 백신의 주요한 표적 항원이다. PLY의 연구를 위하여 Streptococcus pneumoniae D39 균주에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 시행하였다. 합성된 PLY 유전자 DNA를 pQE-30 vector에 삽입하고, E. coli M15에 형질전환 시킨 후 LB 배지에 IPTG를 첨가하여 PLY 단백질을 생산하였다. 재조합 단백질은 $Ni^{2+}$-agarose column을 사용하여 정제하였다. 또한, EGFP를 PLY C-말단에 부착한 융합단백질도 동일한 방법으로 클로닝하여 재조합 단백질을 생산하였다. 500 ng/ml 농도의 재조합 PLY는 1.0% 적혈구 현탁액을 100% 용혈시켰으며, 240 ng/ml 농도는 50% 용혈을 나타내었다. 그러나 재조합 PLY-EGFP는 용혈 활성이 전혀 나타나지 않았으나 형광현미경으로 관찰하였을 때 적혈구 막에 결합되어 있었다. 즉, EGFP의 PLY C-말단 부착은 PLY의 세포막 결합능은 유지시켰으나 용혈기능은 방해하였다. PLY C-말단은 용혈기능에 아주 중요한 영역이며, 세포막 결합은 PLY의 다른 영역이 보다 중요하게 작용할 것으로 추측된다. 따라서, 육안으로 관찰이 가능한 결합능은 가졌으나 용혈 기능이 결여된 PLY-EGFP를 대조군으로 활용함으로써 두 재조합 단백질은 폐렴 유발에 있어서 PLY 작용 연구에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.