In the present study, the localization of myosin and the pathway of myofibrilogenesis of skeletal muscle cells in culture were investigated by immunocytochemical methods including immunoelectron microscopy and hybridoma formation. There were manly free ribosomes in the cytosol of the myoblast. At 48 hr of the culture, the myofilaments started to form and at 72 hr began to assemble to form myoabrils. At this time the Z band appeared, but the sarcomeres did not link together. Aker 96 hr of culture, adjacent sarcomeres linked together and shotved the typical striation of the skeletal muscle fiber. Myosin was synthesized in free ribosomes at 24 hr of culture and localized at many myofilaments at 48 hr and assembled mvoabrils at 72 hr and at 120 hr of the culture, myosin was localized at thick filaments of the A band.
Trypsin을 비롯한 여러 serine protease를 저해하는 단백질을 계골격근으로부터 여러 chromatography 방법을 이용하여 순수하게 분리하였다. 이 저해제의 분자량은 젤 여과법을 이용하여 측정한 결과 66,000 달톤이었으며 sodium dodecyl sulfate 존지하에서 전기영동하였을 때 66,000과 64,000 달톤의 두 단백질로서 나타났다. 이 중 64,000 달톤의 단백질은 순수분리과정 혹은 생체 내에서 일어난 부분 절제현상에 기인한 66,000 달톤 단백질의 부산물인 것으로 사료된다. 이 저해제는 약 7.4의 등전점을 가진 당 단백질임을 알 수 있었으며, 다량의 cysteine잔기를 포함하고 있다.
$(Ca^{2+}+Mg^{2+})$-ATPase를 쥐의 근소포체로부터 sucrose density gradient centrifugation의 방법을 사용하여 분리 정제하였다. 정제된 효소를 폴리아크릴 아마이드 젤에서 전기영동한 결과, 토끼와 닭의 경우에서와 같이 분자량 115,000인 단일 단백질 띠로 나타났다. 정제된 이 효소의 활설도는 50 $\\muM$의 $Mg^{2+}, Ca^{2+}, Co^{2+}, Fe^{2+}, Min^{2+}$에 의해서는 증가되었고, 같은 농도의 $Zn^{2+}, Cu^{2+}, Hg^{2+}$에 의해서는 감소되었다. Quinine와 quinacrine 같은 antimalarial drug는 이 효소의 활성도에 큰 영향을 주지 않았으나, p-hydroxymercuric benzoate와 phenylmethylsulfonylfluoride는 이 효소의 활성을 억제하였다. 이 효소는 pH 6과 7 사이에서 가장 높은 활성을 나타내었고, ATP를 기질로 사용하였을 때 Km 값은 98 $\\muM$이었다. $(Ca^{2+}+Mg^{2+})$-ATPase는 microsomal fraction에서 선택적으로 분해되었다. $^{3}H-casein$ 이나 ^{125}I-insulin같은 방사성 동위원소로 표지된 기질을 사용하여 단백질 분해에 대한 활성도를 조사해 본 결과, microsomal preparation에 metalloendoprotease가 존재하였다. 그러나 아직까지는 그 효소가 $(Ca^{2+}+Mg^{2+})$-ATPase를 분해하는지는 확실하지 않다.
We have previously shown that chick muscle extracts contained at least 10 different ubiquitin C-terminal hydrolases (UCHs). In the present studies, one of the enzymes, called UCH-9, was purified by conventional chromatographic procedures using $^{125}l$-labeled ubiquitin-${\alpha}$NH-MHISPPEPESEEEEE HYC (Ub-PESTc) as a substrate. The purified enzyme behaved as a 27-kDa protein under both denaturing and nondenaturing conditions, suggesting that it consists of a single polypeptide chain. It was maximally active at pHs between 7 and 8.5, but showed little or no activity at pH below 6 and above 10. Lice other UCHs, its activity was strongly inhibited by sulfhydryl blocking reagents, such as iodoacetamide, and by Ub-aldehyde. In addition to Ub-PESTc, UCH-9 hydrolyzed Ub-aNH-protein extensions, including Ub-${\alpha}NH$-carboxyl extension protein of 80 amino acids and Ubo-${\alpha}NH$-dihydrofolate reductase. However, this enzyme was not capable of generating free Ub from mono-Ub-${\varepsilon}NH$-protein conjugates and from branched poly-Ub chains that are ligated to proteins through ${\varepsilon}NH$-isopeptide bonds. This enzyme neither could hydrolyze poly-His-tagged di-Ub. These results suggest that UCH-9 may play an important role in production of free Ub and ribosomal proteins from their conjugates.
The present study describes the production of monoclonal antibodies against cultured chick myoblast to pursue critical proteins in muscle cell fusion. Among a panel of monoclonal antibodies, three, Mll-3H 13, Mll-3Hl8 and Mll-3H35 were inhibited movblast fusion. A single 101-kDa antigen reactive with monoclonal antibody Mll-3H35 was detected by radioimmu-noprecipitation or by immunoblotting. During the course of myogenesis, the level of the protein remarkably decreased as the cells there differentiated. These results suggest that the protein platys a direct role in the process of myoblast fusion mechanism.
지구 온난화와 여름철 고온 환경은 육계의 성장 능력뿐만 아니라 동물복지에도 큰 영향을 미친다. 성장과 근육발달 중심으로 선발된 육계는 열 스트레스를 완화시키는 심장과 폐와 같은 핵심 장기들은 비례적으로 성장하지 못하여 급격한 환경 온도 변화에 대처하기가 어렵다. 환경 온도의 변화는 배아 발달 기간 및 부화 초기까지 근육생성에 큰 영향을 준다. 위성세포 또한 고온 스트레스에 매우 민감하다. 고온스트레스는 위성세포의 증식 및 분화 활동에 영향을 주고, 위성세포의 운명뿐만 아니라, 근육 성장 및 구조에 영향을 미친다. 부화 기간의 정교한 온도조절과 부화 초기 사육 환경 온도의 관리는 육계의 성장과 근육 발달, 그리고 동물복지를 결정하는 데 가장 중요한 핵심 요소이다.
12일간 배양한 계배에서 떼어낸 근모세포에 자외선을 조사하면 근육 분화에 심한 변화를 유발시킬수 있다. 본 연구에서는 자외선이 세포분열 및 근섬유로의 전환, 근모세포와 근섬유의 형태에 미치는 영향을 조사하였다. 자외선을 받은 세포들은 크기가 작아지고 또 적은 수의 세포들이 근섬유 형성에 참여하기 때문에 근섬유의 직경이 좁아지고 길이 또한 작아진다. 자외선이 세포분열과 세포의 융합에 미치는 영향은 배양을 시작한 후 이른 시기에 조사할수록 그 효과가 크다. 또한 자외선의 양을 증가시키면 그 효과가 커져 지나친 양을 조사하면 세포에 치사작용을 나타낸다. 따라서 자외선에 의한 세포 밀도의 감소가 근섬유 형성의 저하를 초래하는 것으로 사료되어 이에 본 연구와 타 실험실에서 얻은 정보를 바탕으로 세포 융합 능력 감소의 원인에 대하여 토의하였다.
In the short-term treahent of 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) or platelet-derived growth factor (PDGF), the'Wh and PDGF induced the Protein Kinase C (PKC) activation and migration from the cytoplasm to the peripheral nulcear membrane. And the activated PKC which was directly or indirectly stimulated by TPA or PDGF Phosphorylated many kinds of PKC's targeting proteins and induces various biological responses. Especially, the cytoplasmic PKC was phosphorylated within 1 hr and 10 min by TPA-and PDGF-treahent respectivelv. In the long-term treatment of TPA or PDGF, both of them induced the down-regulation and translocation of PKC in the mvoblasts. The down-regulation of PKC isozyrnes, the pattern of PKC I and ll was similar to the PKC 111 isozpnes in the cytoplasm. But in the nucleolus, the TPA did not induce and down-regulation or the inhibition of the immunoreactivity of PKC III antibody. This investigation indicates that each isozvmes of PKC mal be performed the different effects to the down-regulation of the cytoplasm or nucleolus. And douvn-regulated myoblasts contained low immunoreactivity of PKC antibodies.
An endogenous 17-6a inhibitor of Caa+_activated protease has been purified from neo-plastic tissues of human stomach using heat treahent and conventional chromatographir procedures. It appears to consist of a single polvpeptide since the same molecular weight was obtained by both gel fntration under nondenaturing condition and gel electrophoresis in the presence of SDS. Since the size of the inhibitor or is the smallest amens those reported so far, it may represent a functional unit for inhibiting Caa+_activated protease. This protein is also capable of inhibiting the protease isolated loom chick skeletal muscle. Thus, the functional unit of the inhibitor most well be conserved during evolution. Howrver, it remains unclear what may be the physiological significance of the presence of the Iow-molecular weight form of the inhibitor in neoplastic tissues of human stomach. 사람의 위암조직으로부터 Ca2)_activated protease을 저해하는 단백질을 열처리 및 여러 크로마토그라피 방법을 이용하여 순수분리 하였다. 이 저해단백질은SDS-전기영동카자1 filtra-tion의 방법에 의하여 그 분자량이 17 kDa으로 나타남으로 보아 단일 Polypeptide로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 이 저해 단백질의 분자량은 지금까지 알려진 CaB+_activated protease의 저해단백질에 비하여 가장 작은 것이었다. 따라서, 이 단.백질은 Ca2)에 의하여 활성화되는 단백질 분해효소의 작용을 저해하는 기능적 단위로 추측되었다. 한편, 이 저해제는 계 골격근에서 추출한 Ca2+ _activated protease의 촹성 도 억제 하는 것으로 나타났다. 이러 한 결과는 이 저 해 단백질의 기능적 단위가 진화과정 동안 오래 보존되어 왔음을 시사한다. 그러나, 사람의 위암조직에서 이 저해제가 무슨 이유로 가장 작은 분자량의 단백질로 존재하는지에 대한 생리학적 중요성에 관한 문제는 앞으로 많이 연구되어져 야 할 것이다.
N-ethylmaleimide는 낮은 농도에서 Myosin heavy chain의 활성화 부위에 존재하는 2개의 황화기에 선택적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. 계 근조직에서 분리된 $Ca^2$+-의존성 단백질 분해효소, Calpain은 이와같이 알킬화된 Myosin heavy chain을 알킬화 되지 않은 것에 비하여 우선적으로 분해하는 것으로 나타났다. 또한, 황화기를 특이하게 산하시키는 KMnO$_4$가 처리된 Myosin heavy chain도 산화되지 않은 것에 비하여 훨씬 빠른 속도로 분해됨을 관찰하였다. 뿐만아니라, N-ethylmaleimide나 KMnO$_4$의 처리는 농도-의존적으로 myosin에 의한 ATP 분해를 불활성화 시키었다. 이러한 결과는 활성화 부위에 존재하는 황화기의 화학적 변형은 Myosin hsavy chain이 Calapin과 같은 세포내 단백질 분해효소에 의하여 인식되는 기구임을 시사한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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