• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제50권4호
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• pp.426-436
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• 2001

흡연은 만성 폐쇄성 폐질환의 가장 흔하고 중요한 원인이며 발생기전으로 단백분해효소 및 그 억제제의 불균형에 의한 폐조직 파괴가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 생체내의 여러 단백분해효소 중 matrix metalloproteases (MMPs) 의 역할에 대한 연구가 최근 활발한데, 이들의 다수는 젤라틴 분해능을 보인다. 연구자들은 흡연에 의한 MMPs의 발현 및 폐기종 발생과의 관련성을 규명하기 위한 첫 단계로 기니픽에서 흡연에 의한 젤라틴 분해 단백분해효소의 발현 양상을 알아보고자 하였다. 방 법 : 500gm 가량의 건강한 기니핀 15마리를 대조군 5마리, 6주 흡연군 5마리, 12주 흡연군 5마리 씩 배정한 후, 하루에 5시간 씩, 담배 20개피를 간접 흡연시키는 과정을 일주일에 5회 반복하였다. 흡연력의 정도에 따른 폐조직 내 세포 침윤의 증가를 알아보기 위해, 폐조직을 H&E 염색한 후 400배 확대 시야에서 보이는 폐포벽의 세포 수를 계산하여 일반선형모델을 이용한 통계 분석법으로 처리하였다. 흡연에 의한 젤라틴 분해 단백분해효소의 발현 양상을 알아보기 위해 기관지폐포세척술을 시행하여 폐포내 세포를 얻은 다음 이를 배양접시에 $1{\times}10^6$개 씩 분주하였는데, 한 배양접시에는 아무 처치도 하지 않았고 다른 한쪽은 0.1mM의 EDTA를 첨가하였다. 48시간의 배 양 후 얻은 상층액으로 'gelatin zymography'를 시행하여 젤라틴 분해 단백분해효소의 발현 및 EDTA에 의한 억제 여부를 관찰하였다. 결 과 : 대조군의 혈중 평균 COHb 농도는 4.1g/dl인 반면, 흡연 노출군의 혈중 평균 COHb 농도는 5시간 노출 직후에는 24g/dl, 노출 후 30분에는 18g/dl, 노출 후 1 시간 후에는 15g/dl 로 측정되어 충분한 흡연노출이 이루어졌다. 400배 시야에서 보이는 폐포벽의 세포 수는 대조군은 $121.4{\pm}7.2$, 6주 흡연군은 $158.0{\pm}20.2$. 12주 흡연군은 $196.8{\pm}32.8$로 측정되어 선형회귀관계가 관찰되었다(p=0.001, $r^2=0.675$). 또한 침윤된 세포의 대부분은 염증 세포였다. 한편, 대조군에서는 젤라틴 분해 단백분해효소가 발현되지 않은 반면에, 6주 흡연군 및 12주 흡연군에서는 젤라틴분해 단백분해효소가 여러 개 관찰되었다. 또한 이 중의 일부는 EDTA에 의해 효소 활성도가 억제되었다. 결 론 : 흡연에 의해 기니픽의 폐조직에서 여러 젤라틴 분해 단백분해효소 발현이 증가하며 이 중의 일부는 MMPs의 억제제인 EDTA 에 의해 억제된다. 이는 흡연에 의해 MMPs의 발현이 증가할 가능성을 시사한다고 하겠다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제45권4호
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• pp.846-860
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• 1998

연구배경: 내독소는 생체 내에서 단구와 내피세포에 강한 자극을 주나 호중구, 림프구, 호염기구, 섬유모세포 등 여러 세포에도 자극효과가 있어 염증반응이 시작된다. 그중 대식세포는 내독소의 자극을 받아 활성화되면 interleukin-1 (IL-1), IL-6, tumor necrosis factor-alpha (TNF-$\alpha$)를 분비하여 조직손상을 일으킨다. 내독소의 작용기전은 CD14 의존성 경로와 비의존성 경로의 두 개로 나뉘어진다. 체내로 들어온 내독소는 혈청 내에서 내독소 운반에 관여하는 LPS-binding protein(LBP)과 결합하여 혈중내에서 세포와 결합되거나 조직으로 이동되어 조직내 세포와 결합하게 된다. 그러나 고농도의 LPS는 CD14항원에 비의존적으로 대식세포를 자극 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지 LPS자극에 의한 대식세포의 CD14 항원 의존성 IL-1, IL-6, TNF-$\alpha$의 형성과정은 많이 밝혀져 있으나, 내독소에 의한 TGF-$\beta$의 형성 여부는 밝혀져 있지 않으며, CD14 항원 비의존성으로 IL-1, IL-6, TNF-$\alpha$ TGF-$\beta$가 형성되는 과정도 별로 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 혈청이 없는 상태 (LBP가 없는 상태)에서, 즉 LPS 자극시 LBP-CD14 비의존성으로 말초혈액단핵구에서 형성된 proinflammatory cytokines인 IL-1, IL-6, TNF-$\alpha$과 섬유화 cytokine인 TGF-$\beta$의 생성유무를 규명하고자 하였다. 방 법: 정상인의 헤파린 처리된 말초혈액정맥혈을 비중 1.077의 Ficoll-Hypaque 용액 위에 중첩시킨 후 500g에서 30분간 원심분리하여 말초혈액단핵구를 얻었다. 분리된 말초혈액단핵구를 우태아혈청이 없는 RPMI에 부유시킨 후 $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$ 보온기에서 0.1 ${\mu}g$, 1 ${\mu}g$, 10 ${\mu}g$, 100 ${\mu}g/ML$의 LPS와 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 시간 혼합 배양 후 상층액을 분리하여 IL-6, TNF-$\alpha$, TGF-$\beta$의 측정 cytokines의 양을 bioassay로 측정하였다. 세포층은 slide에 고정시킨 후 단 클론 항체를 이용한 이중 면역조직화학염색법과 RNA probe를 이용한 in situ hybridization에 이용하였다. 결 과: 실험사약내 내독소 존재 여부에 대한 검증결과 내독소 함유량은 10 ng/mL 이하로 되어 있어 본 실험에서는 10 ng/mL 이상의 농도로 실험을 하였기 때문에 오염된 내독소는 실험에 영향이 없었을 것으로 사료되었다. 말초혈액단핵구에서 LPS 자극에 의하여 IL-6는 1시간째부터 형성되기 시작하였으며 96 시간까지 지속적으로 상승하였고 LPS용량의존성으로 형성됨을 알 수 있었다. TNF-$\alpha$는 LPS 자극 4시간째부터 상승하기 시작하여 시간이 갈수록 생성양은 증가하며 72 시간째까지 지속적으로 형성되었다. TGF-$\beta$형성도 LPS 용량에 의존성을 보이며 8시간째 일차로 TGF-$\beta$의 형성이 증가 한 후 12 시간째는 오히려 감소하였다가 시간이 지남에 따라 다시 증가하여 2차로 96 시간에 최대 형성을 보였다. 각각 cytokine의 24시간째 생성양은 IL-6의 경우 $1{\times}10^5/mL$의 말초혈액단핵구에서 10 ${\mu}g/mL$의 LPS에 의해서 19.8 ng 이 생성되었고 LPS 자극이 없는 상태의 자연생성능도 3.2 ng이었으며, $1{\times}10^6/mL$의 말초혈액단핵구에 의해서 자연 생성양은 증가하여 24시간째에 0.38 ng/mL, 10명/mL의 농도에서 24시간째 4.1 ng/mL의 TNF-$\alpha$의 생성능을 보였다. TGF-$\beta$의 경우 $2{\times}10^6/mL$의 말초혈액단핵구에 의하여 34.4 pg/mL가 생성되었고 자연생성능은 5.2 pg/mL의 생성농을 보였다. 말초혈액단핵구의 IL-1$\beta$, IL-6, TNF-$\alpha$, TGF-$\beta$ 단백과 m-RNA 발현 IL-1$\beta$, IL-6, TNF-$\alpha$단백은 주로 단구세포에서, TGF-$\beta$ 단백은 단구세포와 림프구에서 발현되었으며, CD14항원 발현과는 상관이 없었다. TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, IL-6, TGF-$\beta$ m-RNA 양성세포는 주로 세포질이 풍부한 것으로 보아 단구세포로 사료되었다. TGF-$\beta$의 경우 단구세포외에도 세포질이 적은 림프구에서도 약하게 양성반응을 보여 링프구에서도 분비될 가능성을 보여 주었다. 결 론: 내독소로 말초혈액 단핵구를 자극시 IL-6, TNF-$\alpha$는 조기에 분비되기 시작하며 TGF-$\beta$는 후기에 분비되기 시작하여 96시간까지 지속적으로 분비된다. 주 분비세포는 IL-1$\beta$, IL-6, TNF-$\alpha$의 경우 단구세포가 되며 TGF-$\beta$도 단구세포가 주세포가 되나 림프구도 분비에 관여한다.