• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권1호
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• pp.115-118
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• 2000

Recombinant plasmids harboring a heterologous gene coding for the enhanced green fluorescent protein (EGFP) were transfected and expressed in Drosophila melanogaster S2 cells. A stable transformation of polyclonal cell populations expressing EGFP were isolated after 4 weeks of selection with hygromycin B. The recombinant EFGP expressed in transformed S2 cells consisted of a molecular weight of 27 kDa. EGFP expression was also confirmed by fluorometric measurement. The maximum EGFP concentration was about 9.3 mg/I. The present findings demonstrate not only the successful stable expression of EGFP in Drosophuila was about 9.3 mgI. The present findings demonstrate not only the successful stable expression of EGFP in Drosophila S2 cells, but also the use of EGFP as a reporter to analyze gene expression, with its potential of a Drosophila cell expression system for recombinant protein production being an alternative to a baculovirus-insect cell expression system.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제44권2호
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• pp.69-73
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• 2002

본 연구는 누에신 단백질의 대량발현을 통해 농업용 소재로서 이용하고자 하는 연구의 일환으로 누에 핵다각체병 바이러스 유래의 pBm10po1-Xa 벡터에 누에신 유전자를 도입하여 누에 배양세포(Bm5) 및 누에 생체에서 발현한 결과 누에신 전사체는 바이러스 접종 후 1일째부터 발현되기 시작하여 5일째에 최대로 발현되었음을 확인할 수 있었고, 누에신 단백질은 3일째부터 발현량이 증가하여 5일째까지 계속 지속적으로 발현되었으나 그 발현량은 전사체에서 처럼 많지 않음을 확인할 수 있었으며, 누에신 단백질의 발현량은 누에 세포에 비해 누에 생체에서 기대만큼 그 발현량이 많지 않았다. 또한 누에신의 베큘로바이러스 발현계 (baculovirus expression vector system, BEVS)를 이용하여 세포내 및 번역후 변형과정을 통하여 세포외로 분비된 누에신의 발현양상을 확인한 결과 세포내에 비해 세포외로 분비시 그 발현량이 현저히 줄어들었음을 확인할 수 있었다. 따라서 베큘로바이러스 발현계를 이용하여 외래 단백질을 생산할 경우 정확한 메카니즘은 밝혀지지 않았으나 강력한 프로모터에 의해 세포내 단백질 생산량은 많은데 비해 정확한 단백질 고차구조 형성을 도와주는 foldase 및 chaperon의 양은 한정되어져 있으므로 정확한 고차구조를 형성하여 세포외로 분비되는 생물학적 활성을 띠는 단백질은 매우 적은 양간이 발현됨을 확인할 수 있었다. 그러므로 추후 누에 신 단백질 대량생산을 위해서는 분비 프로세싱의 해명 및 번역 후 변형과정의 개선을 통한 발현계의 개량이 시급히 요구된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권3호
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• pp.355-362
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• 2000

The Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) glycoprotein B (gB) gene in the pHLA-21 plasmid was inserted into a baculovirus (Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus) expression vector (lacZ-HcNPV) to construct a recombinant virus gB-HcNPV expressing gB. Spodoptera frugiperda cells infected with this recombinant virus synthesized and processed gB of approximately 120 kDa, which cross-reacted with the monoclonal antibody to gB. The recombinant gB was identified on the membrane of the insect cells using an immunofluorescence assay. Antibodies to this recombinant raised in mice recognize the viral gB and neutralized the infectivity of the HSV-1 in vitro. These results show that the gB gene has the potential to be expressed in insect cells. They also demonstrate that it is possible to produce a mature protein by gene transfer in eukaryotic cells, and indicate the utility of the lacZ-HcNPV-insect cell system for producing and characterizing eukaryotic proteins. Furthermore, the neutralizing antibodies would appear to protect mice against HSV. Accordingly, this particular recombinant protein may be useful in the development of a subunit vaccine.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제6권1호
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• pp.87-92
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• 2003

We describe here the cloning, expression and characterization of a cDNA encoding a putative chemosensory protein (CSP) from the mole cricket, Gryllotalpa orientalis. The G. orientalis chemosensory protein cDNA sequences comprised of 384 bp with 128 amino acid residues. The G. orientalis chemosensory protein showed 75.4% protein sequence identity to the Locusta migratoria CSP, Northern blot analysis revealed that signal was stronger in head than leg and cuticle, indicating that the head part containing antennae is a main site for G. orientalis chemosensory protein synthesis. The cDNA encoding G. orientalis chemosensory protein was expressed as approximately 12 kDa polypeptide in baculovirus-infected insect cells.

• 한국잠사학회:학술대회논문집
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• 한국잠사학회 2003년도 제46회 춘계 학술연구 발표회
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• pp.82-83
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• 2003

In previous experiment, we reported when the heterologous protein is expressed by using baculovirus expression vector system (BEVS), although the amount of intracellular protein is abundant, the amount of extracellular Protein is poor. As the link in the chain of the research, we investigated the secretory pathway, important in case of the secretory protein, of the protein expressed in insect cells using BEVS. (omitted)

• BMB Reports
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• 제34권4호
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• pp.371-378
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• 2001

The Glycoprotein D (gD) gene of the HSV-1 strain F was cloned, sequenced, recombinated into the HcNPV (Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus) expression vector and expressed in insect cells. The gD gene was located in the 6.43 kb BamHI fragment of the strainF. The open reading frame (ORF) of the gD gene was 1,185 by and codes 394 amino acid residues. Recombinant baculoviruses, GD-HcNPVs, expressing the gD protein were constructed. Spodoptera frugiperda cells, infected with the recombinant virus, synthesized a matured gX-gD fusion protein with an approximate molecular weight of 54 kDa and secreted the gD proteins into the culture media by an immunoprecipitation assay The fusion gD protein was localized on the membrane of the insect cells, seen by using an immunofluorescence assay The deduced amino acid sequence presents additional characteristics compatible with the structure of a viral glycoprotein: signal peptide, putative glycosylation sites and a long C-terminal transmembrane sequence. These results indicate the utility of the HcNPV-insect cell system for producing and characterizing eukaryotic proteins.

• BMB Reports
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• 제41권5호
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• pp.400-403
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• 2008

The insect baculovirus expression vector system (BEVS) is useful for producing biologically active recombinant proteins. However, the overexpressions of foreign proteins using this system often results in misfolded proteins and the formation of protein aggregates. To overcome this limitation, we developed a versatile baculovirus expression and secretion system using Bombyx mori protein disulfide isomerase (bPDI) as a fusion partner. bPDI gene fusion was found to improve the secretions and antibacterial activities of recombinant nuecin proteins. Thus, we conclude that bPDI gene fusion is a useful addition to BEVS for the large-scale production of bioactive recombinant proteins.

• Environmental Analysis Health and Toxicology
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• 제15권4호
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• pp.139-145
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• 2000

FMO (Flavin-containing Monooxygenase, EC1.14.13.8)는 다양한 종류의 식품, 약물이나 기타 외래 유래물질(xenobiotics)을 산화시키는 NADPH와 $O_2$의존성 약물대사 효소이다 현재까지 5종의 subfamility가 존재하는 것으로 보고되어지고 있으며 그 중 가장 잘 알려진 FMO3는 대표적인 subfamility로서 주로 간에 존재한다. 사람 FMO에 관한 연구는 최근들어 활성화되기 시작했으며 질소, 황이나 인 등을 포함하는 친핵성 (nucleophilic)화합물이 대표적인 기질로 보고되어 있다. 본 연구에서는 항 산화작용이 있는 것으로 알려진 selenium을 포함하고 있는 화합물에 대한 사람의 FMO3의 기질특이성을 알아보고자 하였다. 사람 FMO3를 baculovirus system을 이용하여 발현시킨 후 그 microsomal FMO3을 이용하여 thiochline assay를 시행하였다. 그 결과 기질의 크기에 따라 활성의 차이가 있었으며 크기가 작은 selenium화합물은 기존의 질소나 인 등을 포함하는 기질보다 더 낮은 $K_{m}$ 값을 보였다.

• Environmental Analysis Health and Toxicology
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• 제16권2호
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• pp.97-102
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• 2001

FMOs (Flavin-containing monooxygenases, EC1.14.13.8)는 다양한 종류의 식품, 약물이나 기타 외래 유래물질 (xenobiotics)를 산화시키는 NADPH와 $O_2$ 의존성 약물대사효소이다. 현재까지 5종의 subfamily가 존재하는 것으로 보고되어 있으며 그 중 잘 알려진 FMO3는 대표적 인 subfamily로서 주로 간에 존재한다 사람FMO에 관한 연구는 최근 들어 활성화되기 시작했으며 질소, 황이나 인 등을 포함하는 친핵성 (nucleophilic) 화합물이 대표적인 기질로 보고되어 있다. 본 연구에서는 thiocarbamide를 포함하고 있는 화합물에 대한 사람의 FMO3의 기질 특이성을 알아보고자 하였다. 사람 FMO3를 baculovirus system을 이용하여 대량으로 발현시킨 후 그 microsomal FMO3를 분리하여 thiocholine assay를 시행하였다. 그 결과 methimazole, thiourea, and phenylthiourea는 낮은 $K_{m}$ (4-10$\mu$M)간을 갖는 반면, 이보다 기질의 크기가 큰 1 ,3-diphenylthiourea, 1, 3-bis (3, 4-dichlorophenyl)-2-thiourea, 1, 1-dibenzyl-3-phenol-2-thiourea에서는 효소활성이 나타나지 않았다. 이는 사람 fM01과 비교하여 볼 때 큰 차이는 없었으며, 다른 pig, guinea pig, rat, rabbit에서 보다 받아들일 수 있는 기질의 크기가 더 제한적임을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제17권1호
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• pp.18-23
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• 2007

신경세포에 특이적으로 발현되는 단백질인 Fe65는 두 개의 phosphotyrosine binding(PTB) 도메인을 가지고 있다. 두번째 PTB(PTB2)도메인은 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)의 세포질 도메인 조각(AICD)와 결합한다. 최근 연구 결과들은 AICD와 Fe65로 이루어진 결합체가 알츠하이머병에서 신경세포를 죽게 하는 유전자를 발현한다고 제시하고 있다. 따라서 Fe65와 AICD의 결합을 방해하는 화합물은 알츠하이머병을 치료하는데 후보물질이 될 수 있다. 하지만 AICD와 Fe65와 관련된 신호전달에 대한 분자적 기전은 잘 알려져 있지 않다. 이번 연구에서는 Fe65의 PTB2도메인을 baculovirus시스템에서 과발현시킨 결과를 보고한다. 세균 및 척추동물 세포를 이용한 시스템과 비교했을 때, baculovirus 시스템 이 훨씬 효과적 이 다는 것을 발견했다. 정제된 재조합 단백질을 이용하여 초기 결정을 얻었다. 결정을 이용하여 앞으로 밝힐 3차원 구조는 Fe65관련 신호전달체계에 대한 분자 기전 및 이에 대한 저해제 개발에 큰 도움을 줄 것이다.