• 한국가축번식학회지
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• 제20권2호
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• pp.119-126
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• 1996

본 연구는 30% Ficoll과 0.3M sucrose가 함유된 mDPBS 용액에 40%의 ethylene glycol을 첨가함으로서 제조된 EFS40을 이용하여 1-세포기의 생쥐수정란을 효율적으로 동결할 수 있는 적정 조건을 확립하기 위하여 실시하였다. 체외수정에 의해 생산된 생쥐수정란은 1단계 동결법 혹은 2단계 동결법, 두 가지 동결 방법에 의해 각각 초자화 동결되었으며, 동결 후, 융해된 수정란의 생존율은 2-세포기로 분할율과 배양 5일째 탈출배반포기로의 발달율로 각각 검증하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1단계 동결법에서, 수정란을 직접 초자동결액에 1분 동안 노출시켰을 때, 수정란의 생존율은 85.5%, 발달율은 31.9%였다. 수정란을 먼저 20% ethylene glycol에 1, 3, 5분간 노출시킨 후, 1분동안 EFS40 용액으로 옮겨 동결하는 2단게 동결법에서는 1단게 동결법보다 낮은 생존율을 보였다(65.4, 53.6 및 29.6%). 가장 높은 생존율(95.9%)은 EFS40에서 30초동안 노출이 1단계 동결법에서 얻을 수 있었다. 이 조건하에서 2-세포기로 분할된 수정란의 63.8%가 탈출배반포기로 발달하였다. 또한, Differential labelling 기법을 이용하여 Total과 ICM(inner cell mass)의 세포수를 조사한 결과, 초자 동결 후 발달된 배반포의 Total과 ICM 세포수(63.2$\pm$16.9, 13.5$\pm$4.0)와 대조군 세포수(54.0$\pm$15.2, 12.3$\pm$4.6)간에는 각각 유의차가 인정되지 않았다. 이러한 결과는 동결로 인한 수정란의 발달율은 다소 낮았지만, 동결후 융해된 수정란은 정상적으로 배반포까지 발달함을 보여준다. 이러한 결과로 미루어 보아, 본 실험에 사용된 초자화 동결 방법은 1-세포기 생쥐 수정란을 성공적으로 동결시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제13권3호
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• pp.313-321
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• 1998

본 연구는 소 체외성숙, 체외수정 유래 배반포의 초자화 등결 시 동해방지제의 평형방법과 응 해 후 동해방지제의 희석방법이 수정란의 생존성에 미치는 영향을 검토하고자 실시하였다. 초자화 동결액은 20% FBS(Gibco)가 첨가된 D-PBS에 20% glycerol, 20% ethylene glycol, 3/8 M sucrose, 3/8 M deftrose 가 함유된 GESD를 사용하였다. 동결 전 평형방법은 3단계 (El), 2단계 (E2), 1단계(E3)로, 응해 후 희석방법도 Dl(VS3+1/2 M sucrose, 1/2 M sucrose, 1/4 M sucrose), D2 (1/2 M sucrose, 1/4 M sucrose) 및 D3 (1/2 M sucrose)로 구분하였다. 초자화동결 및 융해 후 생존율 은 E1구에서 배반포가 50% (27/54), 확장배반포가 83.6% (46/55)로, E2구 (16.7 및 23.2%) 및 E3구 (0 및 3.7%)에 비하여 유의적으로 높았다(P〈0.01). 융해 후 72시간째 부화율은, E1구에서 배반포가 27.8% (15/54), 확장배반포가 67.3% (37/55)로 E2구(7.4% 및 12.5%) 및 E3구 (0% 및 0%)에 비하석 유의적으로 높았다(P〈0.01). 발육단계별 생존율 및 부화율은 E1구에서 확장배반포의 경우가 배반포에 비하여 유의적으로 (P〈0.01) 높았다. 희석방법에 따른 생존율은 D2구에서 배반포가 52.0% (26/50), 확장 배반포가 80.6% (50/62)로, D1구 (29.6% 및 48.3 %) 및 D3구 (47.2% 및 63.8%)에 비하여 유의적으로 높았다(P〈0.05). 한편, 응해 후 72시간째 부화율은, 배반포의 경우는 세 구간에 차이가 없었으나, 확장배반포의 경우는 D2구에서 61.3% (38/62)로, D1구 (34.5%)에 비하여 유의적으로 높았다(P〈0.01). 발육단계별 생존율은 D1 및 D2구에서, 부화율은 D2 및 D3구에서 확장배반포가 배반포에 비하여 유의적으로(P〈0.01) 높게 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 초자화 동결된 소 수정란의 응해 후 생존성은 동결 전 평형방법 을 다단계로 나누어 실시하므로서 증진될 수 있으며, 응해 후 동해방지제의 희석방법은 동결 전평형에 비하여 생존율에 큰 영향을 미치지는 않으나, sucrose를 이용한 2단계 희석이 수정란의 생존성을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한 발육 단계별 생존성에 있어서는 발육이 진전된 확장배 반포 시에 동결하는 것이 배반포기에 동결하는 것 보다 유리한 것으로 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제23권3호
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• pp.217-222
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• 2008

In previous studies, we reported that sow which was transferred OPS-freezing embryos not able to deliver a piglet (Kim et al, 2004). This study was conducted to investigate a possibility of gilt as recipients which produce piglets after transfer of OPS-freezing embryos. All transferred embryos were prepared by in vitro production (IVP) system. In vitro culture (IVC) medium used glucose-free NCSU23 supplemented with 5mM sodium pyruvate, 0.5 mM sodium lactate and 4 mg/ml bovine serum albumin for 2 days at $39^{\circ}C$. From day 3 of IVC, 10% fetal bovine serum albumin was added to the culture medium. In preparing of freezing embryos, embryos were treated with 7.5 $\mu g/ml$ cytochalasin-B for 30 min and centrifuged at $13,000{\times}g$ for 13 min. And then, embryos were exposed sequentially to an ethylene glycol (EG) solution, aspirated into open pulled straw (OPS), and plunged or thawed into the liquid nitrogen. In embryo transfer (ET), we used two kinds of type (surgical method vs. non-surgical method). In surgical method of embryo transfer, $55\sim65$ embryo were transferred in both uterine horn of two recipient gilts by plastic straw. Non-surgical method which is like artificial insemination was performed on three gilts. Each 140 frozen embryos were transferred to two gilts and 40 fresh embryos to one gilt. Pregnancy establishment was shown one recipient at 45 days after ET. However, the one recipient was also aborted at 58 days after ET. These results suggest that gilts can be considered as a candidate of recipients for OPS-freezing embryo transfer.

• 대한수의학회지
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• 제33권4호
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• pp.757-762
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• 1993

The ovaries of Korean Native cows or heifers were obtained from an abattoir and kept on 20 to $25^{\circ}C$ and transported to laboratory within 2 hrs. The follicular oocystes were collected from 2~6mm follicles in diameter and classified into 3 grades by the morphology of cumulus cells attached. The oocytes were matured in vitro(IVM) for 24 hrs. in TCM-199 supplemented with $23{\mu}g/ml$ FSH, $10{\mu}g/ml$ LH, $1{\mu}g/ml$ estradio-17 ${\beta}$ and granulosa cells at $39^{\circ}C$ under 5% $CO_2$ in air. They were fertilized in vitro(IVF) by incubation for 12 hrs. of epididymal spermatozoa pretreated with heparin, and then the zygotes were co-cultured in vitro(IVC) with oviductal epithelial cells for 7 to 9 days. Assessment of maturation revealed that 93.0%(147/158) of grade I oocytes had expanded of cumulus cells, which was higher(p<0.05) than the 79.4%(85/107) of grade II oocytes. Compared to epididymal sperm(32.9%), the insemination with frozen and thawed sperm resulted in slightly lower(20.5%), but not significant, development to morulae and blastocysts from grade I oocytes. Co-culture of bovine IVF embryos with oviductal epithelial cells improved the development to transferable embryos significantly(38.1%), compared to co-culture with granulosa cells(20.0%). When VF bovine embryos were vitrified at blastocyst, the post-thaw survival rate was obtained higher resulf for 1 min. equilibration time(82.6%) or 2 min.(73.9%) than 3 min.(18.2%) in EFS solution.

• Molecules and Cells
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• 제46권9호
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• pp.538-544
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• 2023

The formation of uniform vitreous ice is a crucial step in the preparation of samples for cryogenic electron microscopy (cryo-EM). Despite the rapid technological progress in EM, controlling the thickness of vitreous ice on sample grids with reproducibility remains a major obstacle to obtaining high-quality data in cryo-EM imaging. The commonly employed classical blotting process faces the problem of excess water that cannot be absorbed by the filter paper, resulting in the formation of thick and heterogeneous ice. In this study, we propose a novel approach that combines the recently developed nanowire self-wicking technique with the classical blotting method to effectively control the thickness and homogeneity of vitrified ice. With simple procedures, we generated a copper oxide spike (COS) grid by inducing COSs on commercially available copper grids, which can effectively remove excess water during the blotting procedure without damaging the holey carbon membrane. The ice thickness could be controlled with good reproducibility compared to non-oxidized grids. Incorporated into other EM techniques, our new modification method is an effective option for obtaining high-quality data during cryo-EM imaging.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제25권1호
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• pp.87-92
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• 1998

본 연구는 생쥐 미수정란을 초자화 동결하였을 때, 체내/외 발달율에 미치는 영향을 연구하고자 실시하였다. 생쥐 미수정란은 30, 35, 40% ethylene glycol, 18% ficoll과 0.5 M sucrose가 함유된 M2 배양액으로 구성 된 EFS30, 35, 40을 이 용하여 초자화 동결되었다. 노출 또는 초자화 동결-융해 후, 형태학적으로 정상적인 미수정란은 $1-2\times10^6/ml$ 농도의 정자로 체외수정되었고, 수정 율과 체내/외 발달율 그리고 배 반포의 세포수 (inner cell mass 와 tropectoderm cell)가 조사되었다. 본 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 35%의 ethylene glycol이 함유된 EFS35에서 EFS30과 EFS40보다 높은 분할율을 나타냈다. 초자화 동결-융해 후 체외수정된 미수정란의 2-세포기까지의 발달을 (51.1%)은 동결없이 초자화 동결액에 노출만된 군 (60.0%)과 대조군 (68.2%)에 비해 유의하게 감소하였다 (p<0.05). 그러나 이들 처리군에 있어서 난할된 난자로 부터의 배반포기 배까지의 발달율에는 유의한 차가 없었다. (75.0, 73.3 과 80.0%). 또한 초자화 동결된 군의 배반포기배 세포수 $(92.5{\pm}2.9)$도 노출군 $(98.5{\pm}5.3)$, 대조군 $(100.9{\pm}4.8)$과 유사하였다. 초자화 동결-융해 하여 얻어진 배반포기배를 가임신 생쥐에 이식하였을 때 체내발달율인 산자발달율 (50.7%)과 착상율 (80.0%)도, 대조군 (58.2, 78.2%)과 유사하였다. 이러한 결과로 보아, 생쥐 미수정란은 ethylene glycol를 기본으로 한 EFS35라는 초자화 동결액을 이용하여 동결보존될 수 있음을 알 수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제10권1호
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• pp.65-72
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• 1995

The purposes of this study were to produce cloned rabbit embryos and offsprings by nuclear transplantation(NT) using in vitro matured oocytes as nuclear recipient cytoplasm and to determine the effect of frozen nuclei donor embryos on the production efficiency of cloned embryos. The 8cell embryos were collected from the mated does by flushing oviducts with Dulbecco's phosphate buffered saline containing 10% fetal calf serum(FCS) at 40 hours after hGG injection. A portion of collected embryos were preserved at 4$^{\circ}C$ for 24 hours and a portion of them were frozen by vitrification method. The embryos used for donor nuclei were synchronized in the phase of Gi /S transition. The in vitro matured oocytes were used as recipient cytoplasm following removing the nucleus and the first polar body. The synchronized blastomeres from fresh, cooled or frozen embryos were injected into the enucleated oocytes by micromanipulation and were electrofused by electrical stimulation of three pulses for 60 $\mu$sec at 1.0 W /cm in 0.28 M mannitol solution. The fused oocytes were co-cultured with a monolayer of rabbit oviductal epithelial cells in M-199 solution containing 10% FCS for 120 hours at 39$^{\circ}C$ in a 5% $CO_2$incubator. Following in vitro culture of the NT embryos to blastocyst stage, they were stained with Hoechst 33342 dye for counting the number of blastomeres by fluorescence microscopy. The nuclear transplant embryos developed in vitro to 2- to 4-cell stage were transferred into the oviducts of synchronized recipient does. The results obtained were summarized as follows: 1. The fusion rates of the blastomeres from fresh, cooled and frozen embryos with the in vitro matured and enucleated oocytes were 100, 95.8 and 64, 3%, respectively. 2. Development in vitro to blastocyst was significantly(p<0.05) different between the cloned embryos with the blastomeres from fresh, cooled or frozen embryos as 39.0, 20. 9 and 15.7%, respectively. 3. The mean numbers of cell cycle per day during in vitro culture of cloned embryos blastomeres from fresh, cooled or frozen embryos was 1.31, 1.29 and 1.16, respectively. 4. A total of 77 nuclear transplant embryos were transferred into 6 recipient does, of which two offsprings were produced from a foster mother 31 days after embryo transfer.

• 한국방사성폐기물학회:학술대회논문집
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• 한국방사성폐기물학회 2004년도 학술논문집
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• pp.97-104
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• 2004

원자력시설의 해체를 위한 표면오염도를 측정함에 있어 기존의 일반적인 단일층 함침 복합체의 단점을 개선한 치밀한 구조의 지지층 위에 활성층의 2차막을 도포 하여 제조된 이중 구조의 고분자 복합체를 제조하고 이들의 특성을 분석하였다. 세륨활성화된 이트리움실리케이트(Cerium-activated ytttrium silicate, CAYS)를 함침시킨 폴리설폰 이중구조 필름은 1차 지지층으로서 폴리설폰 (polysulfone, PSF)과 메틸렌클로라이드 (methylene chloride, MC)로 이루어진 2액용액을 유리판 위에 제막하고 증발을 통해 MC를 제거하여 고분자의 유리화(vitrification)를 통해 치밀한 구조로 고형화하도록 하였다. 고형화한 1차층 위에 CAYS 와 용매로 이루어진 2차 제막용액을 덧붙여 도포하고 물에 침지시키거나 대기방치를 통해 고형화시켰다. 이렇게 이루어진 2중 구조의 무기섬광체 함침 복합체 필름은 2차 제막층에 손가락 형태의 큰 기공이 생성되었으며, 1차층과 2차층이 완전히 결합되어 있어 우수한 기계적 물성을 나타냈다. 한편, 섬광체인 CAYS를 첨가하였을 때 필름에 생성되는 은 기공의 형성이 증대되는 특성을 보였으며, 용매의 증발에 의해 고형화 된 필름은 치밀한 구조의 형상을 보였다. 제조된 필름들은 방사성핵종의 탐지에 있어 신뢰할만한 탐지 결과를 보였다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제45권3호
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• pp.143-148
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• 2018

Objective: The favored method of preserving fertility in young female cancer survivors is cryopreservation and autotransplantation of ovarian tissue. Reducing hypoxia until angiogenesis takes place is essential for the survival of transplanted ovarian tissue. The aim of this study was to investigate the role of angiopoietin-1 (Angpt-1), angiopoietin-2 (Angpt-2), and vascular endothelial growth factor (VEGF) in ovarian tissue grafts that were cryopreserved using two methods. Methods: Ovarian tissues harvested from ICR mice were divided into three groups: group I (control), no cryopreservation; group II, vitrification in EFS (ethylene-glycol, ficoll, and sucrose solution)-40; and group III, slow freezing in dimethyl sulfoxide. We extracted mRNA for VEGF, Angpt-1, and Angpt-2 from ovarian tissue 1 week following cryopreservation and again 2 weeks after autotransplantation. We used reverse transcriptase-polymerase chain reaction to quantify the levels of VEGF, Angpt-1, and Angpt-2 in the tissue. Results: Angpt-1 and Angpt-2 expression decreased after cryopreservation in groups II and III. After autotransplantation, Angpt-1 and Angpt-2 expression in ovarian tissue showed different trends. Angpt-1 expression in groups II and III was lower than in group I, but Angpt-2 in groups II and III showed no significant difference from group I. The vitrified ovarian tissues had higher expression of VEGF and Angpt-2 than the slow-frozen ovarian tissues, but the difference was not statistically significant. Conclusion: Our results indicate that Angpt-2 may play an important role in ovarian tissue transplantation after cryopreservation although further studies are needed to understand its exact function.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권2호
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• pp.155-163
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• 2004

본 연구는 도축돈의 난소로부터 난자를 채취하여 체외배양시킨 후 세포 안정제와 원심분리 그리고 OPS를 이용한 유리화동결 하였다. 동결 융해한 수정란을 경산돈에 외과적 또는 비외과적으로 이식하여 자돈을 생산하는 것을 목적으로 수행하였다. ${\cdot}$ 도축돈 난소로부터 채란되어진 돼지 미성숙난은 Funahashi 등(1994) 방법에 따라 체외 성숙-수정-배양하였다. 체외배양액은 glucose-free NCSU 23을 이용하였으며, 5일째에 10% Fatal bovine serum (FBS)을 첨가 배반포로 발달을 유도하였다. ${\cdot}$ 체외배양된 수정란은 7.5${\mu}$g.mL cytochalasin B에 30분 처리 후 13,000 rpm에 13분간 원심 분리하였고, ethylene glycol(EG) 동결액으로 처리한 뒤 OPS를 이용하여 동결${\cdot}$융해하였다. ${\cdot}$ 동결수정란과 비동결수정란을 plastic straw에 loading 한 후 3두에는 경산돈에 외과적 방법으로 각각 100개, 100개의 동결수정란과 대조군으로 34개의 비동결수정란을 이식하였고 다른 3두에는 비외과적 방법으로 각각 150개, 150개의 동결수정란과 대조군으로 100개의 비동결수정란을 각각 이식하였다. 외과적이식돈의 대조군에 사용한 신선수정란은 비경산돈 3두에서 채란하였다. ${\cdot}$이식 결과 6두 모두 지연성 발정을 보였으며 이중 동결수정란 이식돈은 임상적으로 정상이였으나 비동결수정란은 이식한 경우는 자궁내막염과 복강탈장이 관찰되었다. 주요 원인은 시술시 기술의 미숙과 야외수술에 의한 감염, 난자의 이동과 수송에 의한 영향 그리고 주입 미숙 등이 주요 원인인 것으로 생각되며 융해 후 생존효율이 높은 수정란의 준비, 이식 기술의 개선과 자궁상태가 청결한 비경산돈의 이식으로 임신율을 높일 수 있을 것으로 기대된다.