• 미생물학회지
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• 제46권4호
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• pp.383-388
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• 2010

알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이 균주 Vibrio metschnikovii L12-23, N4-8, KS1으로부터 알칼리성 단백질 분해효소를 암호화하는 vapK (Vibrio alkaline protease K) 유전자들을 PCR에 의하여 분리한 다음 DNA shuffling, error-prone PCR 방법과 같은 분자진화 기술을 통해 고활성 단백질 분해효소를 생산하는 재조합 V. metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해 재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V. metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2 copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V. metschnikovii RH530에 비해 43.6배 높은 단백질 분해활성을 보였으며 숙주인 V. metschnikovii KS1에 비해 약 3.9배 향상된 단백질 분해 활성을 확인할 수 있었다. 변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다. 변형된 유전자 vapK-1을 two copy를 포함한 재조합 플라스미드를 가진 V. metschnikovii KS1을 30 L fermentor로 배양 하였을 때 배양 후 35 시간에 18,000 PU/ml의 활성을 보였으며, 이는 향후 산업용 균주로서 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제11권2호
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• pp.222-228
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• 2001

Vibrio metschnikovii strain RH530 is a non-pathogenic, industrially-important alkaline protease producer which has been isolated from wastewater. In this paper, we report on the transformation of this strain by using the method of electroporation. A field strength of $7.5\;kVcm^{-1}$ and $25\;{\mu}F$, and using a 0.2-cm cuvette, appeared to be the optimal conditions for electroporation of the cells with the recombinant pSBCm plasmid carrying the vapK alkaline protease gene and the ColE1 replicon. Cells were subjected to osmotic shock in order to remove extracelluar DNase, and adding 200 mM of sucrose to electroporation buffer cells showed an increased transformation efficiency. Maximum efficiency of transformation was obtained at an early exponential growth phase. Using all of the conditions mentioned above, we routinely obtained a transformation efficiency of more than $10^4{({\mu}g\;plasmid\;DNA)}^{-1}$. The stability of the plasmid pSBCm in V. metschnikovii RH530 was 25% after 18h of growth (27 generations) in the medium without antibiotic selection. The insertion of the par locus to the pSBCm increased the stability of the plasmid up to 42% without selective pressure. The increase in plasmid stability was accompanied by the increase in the productivity of alkaline protease in the recombinant V. metschnikovii strain RH530. Determining optimal conditions for the transformation of the industrially-important, nonpathogenic Vibrio strain, and the improvement of plasmid stability by introducing the par locus into the high copy number plasmid vector, will allow the development of procedures involved in the genetic manipulation of this strain, particularly for its use in the production of industrial enzymes such as alkaline protease.

• 미생물학회지
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• 제32권2호
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• pp.120-125
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• 1994

Vibrio meschnikovii 균주 RH530의 trpB. trpA 및 3‘ trpC(F) 유전자를 대장균에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. trpB 및 trpA 유전자는 각각 391 및 268 아미노산을 coding할 수 있는 1,173 bp 및 804 bp의 open reading frame을 가졌다. trpB 및 trpA 유전자는 일반적인 ribosome-binding sequence를 가졌으며 1개의 nucleotide만큼 중복되어 있었다. 이는 이들 두 유전자가 trinslation 단계에서 연결되어 있음을 의미한다. trpB 유전자의 개시토돈에서 115 nucleotide 위에 trpC(F)와 trpF의 융합체인 trpC(F)의 3’-말단부위의 불완전한 open reading frame의 존재 하였다. V. metschnikovil RH530의 TrpB, TrpA 및 TrpC(F)의 아미노산 서열은 V. parahaemolyticus의 그것들과 각각 64.2%, 82.4%, 73.7%: S. typhimurium과 58.7%, 72.3%, 54.9%: B. lactoermentum과 42.6%, 54.1%, 12.5%의 유사성을 보였다. 이는 TrpB가 TrpA보다 서열이 잘 보존되어 있음을 나타내며 TrpC(F)는 다를 두 polypeptide에 비해서 서열의 변이가 큼을 나타낸다. 이들 유전자들의 구조, 특히 trpC(F)와 trpB 사이의 noncoding 부위는 Enterobacteriaceae 비롯한 다를 개체들과는 다른 특징을 보였다.

• 환경생물
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• 제17권4호
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• pp.439-448
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• 1999

1997년 11월부터 1998년 6월까지 총 4회에 걸쳐 군산인근 해역을 대상으로 Vibrio 속의 분포와 특성을 조사하였고, 분리동정된 Vibrio 속 3종(V. anguillarum, V. vulnificus, V, metschnikovii)을 대상으로 해수에서 수온 변화에 따른 생존을 관찰하였다. 조사 기간 중 총 해양 종속영양 세균의 분포는 평판도말법으로는 1.2$\pm$0.6$\times$$10^3$~2.0$\pm$1.5$\times$$10^4$CFU ml­$^1$을 나타냈으며, 형광현미경에 의한 직접측정법으로는 6.0$\pm$4.0$\times$$10^{5}$ ~1.9$\pm$1.5$\times$$10^{7}$ cells ml­$^1$의 범주에서 변화하여 측정방법에 따라 커다란 차이를 보였다. 해양 Vibrio의 분포는 1$\times$10~6$\pm$2.2$\times$$10^2$CFU ml­$^1$의 범주에서 변화하여 전반적으로 총 해양종속영양 세균의 수에 대하여 차지하는 비율은 0.l~6%였다. 최종 분리된 51균주를 Biolog Identification System$^{TM}$에 의해서 동정한 결과 V. mediterranei(11균주), V. anguillarum(13균주), V. netschnikovii(5균주), V. parahaemolyticus(5균주)등이 우점속으로 밝혀졌다. 분리 동정된 51균주들 간의 통계학적 유사도를 70%이상을 기준으로 grouping한 결과 26 group으로 나뉘어 본 조사해역에서 Vibrio 속의 다양성을 간접적으로 보여 주고 있다. 동정된 균주들에서 plasmid의 존재를 확인한 결과 65%에 해당하는 33균주가 plasmid를 갖고 있었으며 그 크기는 12kb이상으로 나타났다. 또한 분리된51균주들에 대하여 7종의 항생제 (gentamicin, ampicillin, chlorarnphenicol, streptomycin, kanamycin, tetracycline, carbenicillin)에 대한 내성을 측정한 결과 51균주들 중 96%가 한 종류 이상의 항세균제에 대하여 내성을 나타냈다. 분리 동정된 균주들 중 V. angulliarum, V. vulnificus, V. metschnikovii를 대상으로 여과된 해수에 접종시켜 생존율을 4, 15, $25^{\circ}C$에서 30일간 측정한 결과 15$^{\circ}C$에서 가장 높은 생존율을 보였다.

• 미생물학회지
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• 제40권2호
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• pp.133-138
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• 2004

본 연구는 2002년 6월부터 2003년 11월까지 복수증을 나타내는 양식넙치의 세균상과 virus를 동정한 것이다. 생화학적 성상을 기초로 한 표현형으로, 병어체의 복수, 간, 신장, 내장으로부터 Vibrio, Edwardsiella, 및 stonella 등 3개 속이 동정되었다. Vibrio속은 5종으로 우점이었고 V. harveyi (32균주), V. parahaemolyticus (23균주), V. alginolyticus (10균주), V. carcariae (2균주), V. metschnikovii (5균주)였다. 그밖에 Photobacterium damselae (6균주)와 장내세균인 Edwardsiella tarda (15균주)가 동정되었다. 감염어의 내부 장기로부터 해산어 병원성 바이러스로 알려진 marine birnavirus (MABV)가 분리되었다.

• 한국수산과학회지
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• 제30권3호
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• pp.361-366
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• 1997

금강 하구의 물에서 분리된 sucrose 분해성 Vibrio 속 중에 용혈독소를 생산하는 균주의 독성을 시험한 결과와 기존에 알려진 12종의 병원성 Vibrio 녹과 비교한 결과는 다음과 같다. 1. 분리된 장소의 환경조건은 염도가 $4.7\%_{\circ}$, pH가 7.6, 수온이 $24^{\circ}C$ 및 conductivity가 $7800{\mu}MHOS$이었다. 2. 생리, 생화학적 특성과 염분 요구도를 비교한 결과 sucrose를 분해하는 병원성 Vibrio인 V. alginolyticus, V. cholerae, V. cincinnatiensis, V. fluvialis, V. furnissii 및 V. metschnikouii와는 확실히 구별되었다. 3. 생육가능한 염도는 $0.5\~7.5\%_{\circ}$이었으며 생육가능한 pH는 $4.5\~9.5$이었다. 4. TCBS 평판한천배지에서 균의 집락은 전형적인 황색집락이었으며, 전자현미경에 나타난 균의 형태은 콤마상 간균이었다. 5. 새앙쥐에 대한 치사독성이 확실하였으며, 사람과 면양 적혈구에 대한 용혈성이 확인되었고 rat 피부혈관 투과성 항진작용이 양성이었다. 이상의 결과로 이 균은 병원성이 확인되었고 기존에 알려지지 않은 Vibrio 속으로 확인되어 이 균을 Vibrio sp. D5로 명명하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권3호
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• pp.349-354
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• 2000

Abstract A facultative alkalophilic gram-negative Vibrio metschnikovii strain RH530, isolated from the wastewater, produced several alkaline proteases (VAP) including six alkaline serine proteases and a metalloprotease. From this strain, high yielding YAP mutants were isolated by NTG treatment. The isolated mutant KS1 showed nine times more activity than the wild-type after optimization of the culture media. The production was regulated by catabolite repression when glucose was added to the medium. The effects of several organic nitrogen sources on the production of the YAP were investigated to avoid catabolite repression. The combination of 4% wheat gluten meal (WGM), 1.5% cotton seed flour (eSF), and 5% soybean meal (SBM) resulted in the best production when supplemented with 1% NaCl. The YAP showed a resistance to surfactants such as $sodium-{\alpha}-olefin$ sulfonate (AOS), polyoxy ethylene oxide (POE), and sodium dodecyl sulfate (SDS), yet not to linear alkylbenzene sulfonate (LAS). However, the activity of the YAP was restored completely when incubated with LAS in the presence of POE or $Na_2SO_4$. The YAP was stable in a liquid laundry detergent containing 6.6% SLES (sodium lauryl ether sulfate), 6.6% LAS, 19.8% POE, and stabilizing agents for more than two weeks at $40^{\circ}C$, but the stability was sharply decreased even after 1 day when incubated at $60^{\circ}C$. A washing performance test with the YAP exhibited it to be a good washing power by showing 51 % and 60% activity at $25^{\circ}C{\;}and{\;}40^{\circ}C$, respectively, thereby indicating that the YAP also has a good detergency at a low temperature. All the results suggest that the YAP produced from the mutant strain KSI has suitable properties for use in laundry detergents.rgents.