버섯 재배상(栽培床에)서 Trichoderma속(屬)을 분리, 동정하고 아울러 Trichoderma속(屬)이 생산하는 항생물질(抗生物質)이 느타리버섯균의 생육에 미치는 영향을 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 분리된 Trichoderma속(屬)은 Rifai의 검색표에 따라 동정한 결과 Trichoderma hamatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii로 확인되었다. 2) 분리 동정된 Trichoderma속(屬) 중에서 Trichoderma viride(No. 10)이 느타리 버섯균 생육(生育)에 대한 저해율이 제일 높았다. 3) 각종 버섯균 중에서 Trichoderma viride(No. 10)에 의한 저해는 Pleurotus ostreatus와 Pleurotus sajor-caju가 제일 심했고 그 다음으로는 Lentinus edodes, Flammulina velutipes, Auricularicula auricula순이었다. 4) 추출된 백색 침상 결정 항균력(抗菌力)은 각각 1/10의 농도와 500ppm의 농도에서 cycloheximide $100{\sim}200ppm$의 항균력(抗菌力)에 해당하였다.
Trichoderma viride QM 9414의 생육을 저해하여 colony를 형성 시키고 배지에 첨가된 cellulose가 균이 분비한 cellulase에 의해서 분해되어 생긴 clear zone으로서 육안으로 cellulase 역가를 쉽게 측정할 수 있는 방법과 repressor를 첨가하여 constitutive mutant를 선별할 수 있는 방법에 관한 실험을 하였든 바 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) Colony를 형성시키고 그 size를 제한 하는데는 deoxycholate를 배지에 0.15% 첨가 하였을 때 가 가장 좋았다. 2) Saponin을 배지에 0.l% 첨가하면 뚜렷한 clear zone을 형성하였다. 3) Constitutive mutant를 선별하기 위해서는 기질로 pulp를 사용하였을 경우 glucsoe를 1% 첨가하거나 glycerol이나 cellobiose를 0.5% 첨가하면 가능하다고 생각되며 기질로 pure cellulose를 사용하였을 경우는 그대로 배지에 spore를 plating하면 가능하다고 생각된다. 4) Cellulase 역가가 높은 균주는 clear zone의 크기로서 쉽게 분리할 수 있다.
Trichoderma viride의 변이주인 QM9123, QM9414, TK041 및 MCG77은 면역학적으로 동일한 cellobiohydrolase을 분비하는 결과로서 변이균주간은 구조 유전자는 동일하나 조절유전자가 변이했음을 알 수 있었고 탄소원의 cellobiohydrolase의 유도효과는 고분자 섬유소인 Alpha-cellulose와 Solk Floc의 가장 좋은 유도체였고, 저분자 유도체인 cellobiose와 CMC에 의해서 유도되는 형식이 다름을 알았다.
Penicillium funiculosum과 Trichoderma viride cellulase의 정제효소들을 사용하여 cross-synergism을 조사하였다. Exo-exo형 상승작용이 Avicel을 분해하는데 가장 효과적이었으며 exo-endo형은 다소 효과가 떨어졌다. 정제효소성분과 이종의 조효소를 혼합하여 70시간 이상 Avicel을 가수분해하며 생성된 total sugar를 측정한 결과, P. funiculosum cellulase에서 분리정제한 $\beta$-glucosidase 성분효소는 T. viride cellulase와 상승작용을 크게 나타내며 Avicel을 가수분해하였다. 또한, T. viride cellulase에서 분리정제한 exoglucanase 성분효소도 P. funiculosum cellulase의 가수분해능을 크게 향상시켰다. 이와같은 결과로 미루어 볼 때, 이종의 cellulase로 부터 부족한 성분효소를 보충시켜 효소성분비율을 변화시킴으로써 Avicel의 가수분해도를 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다. 이 때 최대한 높은 가수분해를 얻기 위하여 여러 형식의 상승작용이 같이 이루어져야할 것이다.
Trichoderma viride가 분비하는 cellobiohydrolase를 항원으로 사용하여 이 섬유소 분해효소에만 특이적인 항체를 얻을 수 있었다. 이 항체를 이용하여 column single immunodiffusion 방법에 의해서 cellobiohydrolase의 농도 2-10 $\mu\textrm{g}$ 범위 내에서는 직선적으로 정량 할 수 있었고, ELISA 방법을 사용할 때는 $10^6$의 항체 희석시는 40-110ng, $10^5$ 항체 희석시는 100-1,200pg 농도범위의 cellobiohydrolase 를 정량 할 수 있었다.
키토산 올리고당 생산에 이용 가능한 경제성 있는 키토산 분해 효소를 탐색하였다. Cellulase, ${\beta}-1,4-glucosidase,\;protease$ 및 상업용 효소류를 대상으로 조제 키토산에 대한 분해력을 시험한 결과 Trichoderma viride, T. reesei 유래의 cellulase 및 상업용 효소인 Celluclast (T. reesei 유래 cellulase)가 우수한 키토산 분해능력을 나타내었다. 키토산에 대한 반응성은 T, reesei 유래 cellulase가 T. viride 유래 cellulase 보다 강하였으며 이들의 적정 키토산 분해조건은 pH 5.0이었고 적정 온도는 T. viride 유래 celluclast는 $45^{\circ}C$, T. reesei 유래 cellulase 및 Celluclast는 $55^{\circ}C$로 나타났다. 또한 dose reponse시험에서 이들 효소 모두 enz./chitosan비=0.1이 적절하였으며 T. reesei 유래 효소 및 Celluclast는 키토산 농도가 3%일 때 최대의 활성을 나타내었다. 한편, 상업용 효소인 Celluclast를 이용한 키토산 올리고당의 생산 가능성을 시험하기 위하여 3% 키토산 용액(310cp)에 Celluclast를 1% 첨가하고 $pH\;5.0,\;55^{\circ}C$에서 시간별로 반응시켰을 때, 점도는 초기30분경에 5.51cp로 98% 이상 감소하였으며 50% ethanol 가용물의 수율은 분해 15시간에 70%로 최대를 보였다. 총환원당의 함량은 분해시간이 경과함에 따라 증가하였고 반응 2시간부터 13.5% 내외의 수준을 유지하였다. 올리고당의 조성은 15시간 분해물에서 균일한 분포와 높은 함량을 보였으며 항종 양활성을 나타내는 것으로 알려진 6량체 키토산 올리고당의 생성량은 기존의 산 분해방법의 약 4배에 해당되는 8.0%로 나타났다. 따라서 T. viride 및 T. ressei 유래의 cellulase는 99% 이상의 탈아세틸화도를 가지는 키토산에 대하여 분해활성을 나타내고 특히 T. reesei유래의 상업용효소는 지금까지 효소가격이 너무 높아 활용되지 못한 chitosanase를 대신하여 키토산 올리고당을 경제성 높게 생산하는 데 이용될 수 있을 것으로 기대되었다.
Crude cellulases freshly prepared from cultures of Aspergillus niger, Prnicillum motatum, Trichoderma vride 16273 and Trichoderma viride 16374 were assayed on 4 different substrates including Na-CMC, cellulose powder, starch and sucrose. Enzyme prepared from A. niger contained highly active hydrolytic enzymes of the 4 substrates assayed. P. notatum [yielded relatively lower amount of cellulase but the extracts were also highly reactive on starch and sucrose. Trichoderma viride 16274 yielded very little cellulase and invertase, but the extracts showed a high degree of amylase activity. Trichoderma viride 16374, however, yielded collulase comparable to that of Penicillium notatum, but lower activities of amylase and invertase were seen. Commercial cellulases prepared from Penicillium notatum (cellulase[K]) and Trichoderma viride(cellulase[J]) indicated enzyme activities closely parallel to the crude enzymes freshly prepared from fungus cultures. The optimum pH's of cellulolytic activities of cellulase[K] and cellulase[J] were 4.0 and 5.0 respectively. The optimum temperatures of the cellulolytic activities of cellulase[K] and cellualse[J] were 4.0 and 5.0 respectively. The optimum temperatures of the cellulolytic activities of cellulase [K] and cellulase [J] were $60{\circ}C$ and $50{\circ}C$ respectively. Assuming the average molecular weight of Na-CMC is about 115,000, the Km values of cellulase [K] and cellulase[J] were found to be $3.3{\times}10^{-5}/nM$ and $3.3{\times}10^{-4}/nM$ respectively.
Influence of physiological and environmental factors on an antagonistic strain of Trichoderma viride RSR7 were studied optimize its biocontrol potential. The growth and sporulation of T. viride was greatly influenced by various carbon and nitrogen sources, and the environmental factors such as pH and temperature. The best growth and sporulation of T. viride was observed when sucrose, peptone and trehalose were supplemented in the medium as sole carbon sources. Rhamnose, pyruvic acid and sorbitol also supported a good growth. However, with these carbon sources the sporulation was poor. Growth and sporulation was also affected by various nitrogen sources. Growth and sporulation both were favoured by ammonium forms of nitrogen compared to nitrite or nitrate forms. Urea did not support either growth or sporulation. Among amino acids, glutamic acid, asparagine, leucine, aspartic acid, glutamic acid and alanine supported good growth as well as sporulation. T. viride was able to utilize large number of amino acids as sole nitrogen source. Proline was good for growth, but not for sporulation. Maximum growth and sporulation of T. viride was between pH 4.5 to 5.5. Temperatures between $20^{\circ}C\;and\;37^{\circ}C$ were good for both growth and sporulation of T. viride. At lower temperatures(i.e. below $20^{\circ}C$) growth and sporulation were inhibited. Based on the present study it may be concluded that T. viride RSR7 is capable of growing and sporulating with varied nutritional and environmental conditions and, therefore, this strain of T. viride may be useful as a biocontrol agent under diverse physiological and environmental conditions.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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