• Toxicological Research
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• 제32권1호
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• pp.81-87
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• 2016

Aflatoxin B1 (AFB1) is produced by Aspergillus flavus growing in feedstuffs. Early detection of maize contamination by aflatoxigenic fungi is advantageous since aflatoxins exert adverse health effects. In this study, we report the development of an optimized conventional PCR for AFB1 detection and a rapid, sensitive and simple screening Real-time PCR (qPCR) with SYBR Green and two pairs of primers targeting the aflR genes which involved aflatoxin biosynthesis. AFB1 contaminated maize samples were divided into three groups by the toxin concentration. Genomic DNA was extracted from those samples. The target genes for A. flavus were tested by conventional PCR and the PCR products were analyzed by electrophoresis. A conventional PCR was carried out as nested PCR to verify the gene amplicon sizes. PCR-RFLP patterns, obtained with Hinc II and Pvu II enzyme analysis showed the differences to distinguish aflatoxin-producing fungi. However, they are not quantitative and need a separation of the products on gel and their visualization under UV light. On the other hand, qPCR facilitates the monitoring of the reaction as it progresses. It does not require post-PCR handling, which reduces the risk of cross-contamination and handling errors. It results in a much faster throughout. We found that the optimal primer annealing temperature was $65^{\circ}C$. The optimized template and primer concentration were $1.5{\mu}L\;(50ng/{\mu}L)$ and $3{\mu}L\;(10{\mu}M/{\mu}L)$ respectively. SYBR Green qPCR of four genes demonstrated amplification curves and melting peaks for tub1, afIM, afIR, and afID genes are at $88.0^{\circ}C$, $87.5^{\circ}C$, $83.5^{\circ}C$, and $89.5^{\circ}C$ respectively. Consequently, it was found that the four primers had elevated annealing temperatures, nevertheless it is desirable since it enhances the DNA binding specificity of the dye. New qPCR protocol could be employed for the determination of aflatoxin content in feedstuff samples.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제20권5호
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• pp.699-704
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• 2013

메밀 속성장은 메밀과 콩으로 제조된 별미장이다. 항균 및 효소활성이 우수한 B. subtilis HJ18-4 균주를 starter로 사용하여 메밀 속성장을 제조하였다. 메밀 속성장 제조과정 중, starter 첨가 시기는 메주 제조단계(Treat-1) 및 염수 첨가단계(Treat-2)로 접종시기를 달리하였다. 발효 중 아미노태질소 함량, 환원당, 효소활성(protease, amylase)의 이화학적 품질특성과 총균 수, 유산균 수 및B. cereus 양 변화 등의 미생물학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 총균 수는 발효 15일부터 7~8 log CFU/mL로 증가되었고 아미노태 질소함량은 발효기간 동안 65.38~202.52 mg%로 증가되었다. 반면, 환원당과 효소활성(amylase, protease)은 모든 처리구 에서 감소하였다. 발효기간 중 PlcR 발현에 미치는 영향을 측정한 결과, Treat-1 처리구에서 발효 23일 이후 검출되지 않았다. 메주 제조단계에서 B. subtilis HJ18-4를 접종한 Treat-1이 발효관련 이화학적 특성과B. cereus 저해효과가 우수하였다. 단일 균을 접종하여 제조되는 개량식장 제조 시, 자연발효에 제조된 장의 품질을 재현하기가 매우 어려운 실정이다. 본 연구는 자연발효방법으로 제조되는 메밀 속성장에 항균 및 효소활성이 우수한B. subtilis HJ18-4 균주를 스타터 적용하여 장류 품질개선 방법을 제시하였다.

• 미생물학회지
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• 제44권4호
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• pp.305-310
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• 2008

황색포도상구균은 주요한 기회 감염균으로, 최근 여러 가지 항생제에 내성을 지닌 메치실린 내성 황색포도상구균 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)이 늘어나 문제가 되고 있다. 이에 본 연구에서는 인천지역관내 설사환자에서 분리한 장독소 양성인 S. aureus를 대상으로 항생제 감수성시험 및 PCR을 이용한 tsst, eta, etb mecA 유전자 검사를 실시하여 생물학적인 특성을 조사하였고, tsst 양성인 MRSA를 대상으로 Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE)에 의한 유전자형을 분석함으로서 경시적인 분자역학적 특성을 파악하고자 하였다. 그 결과 2,281건의 대변에서 173주의 장독소 양성인 S. aureus를 분리하였으며 A독소와 C독소가 각각 39%, 58%를 차지하는 것으로 나타났다. 항생제 감수성 결과 장독소 양성주는 모두 MRSA였으며, 이중 51%가 tsst 양성인 것으로 나타났고 eta, etb 유전자는 검출되지 않았다. mecA 내성유전자는 MRSA 균주의 97%가 양성으로 나타났다. tsst 양성인 MRSA 88주를 대상으로 PFGE한 결과, 10개의 유형으로 나뉘었으며 그중 A형, H형 및 F형 이 각각 58%, 10%, 9%로 주요한 형으로 나타났다.

• 생태와환경
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• 제50권1호
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• pp.137-147
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• 2017

독소 생성 분류군의 정의는 분리균주에 의해서 동정되고, 단일배양에 의한 독소 생성 여부 및 유전적 검토가 확인된 분류군을 의미한다. 이러한 관점에서 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성능은 세계적으로 아직 논쟁의 여지가 있다. 본 연구는 낙동강에서 분리한 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC001, DGUC003)을 대상으로 16S rRNA 염기서열을 이용하여 계통학적 위치를 확인하고, 남세균독소인 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN)의 잠재적 생성능력을 유전자 수준에서 검토하였다. 연구에 사용된 균주는 2016년 8월과 2016년 10월에 낙동강 본류구간의 하천수에서 분리되었다. 계통학적 분석에는 16S rRNA가 사용되었으며, 독소 생성 유전자는 CYN과 STX 생합성에 관여하는 cyrA, cyrJ, sxtA, sxtI 유전자가 선택되었다. 분리된 균주 DGUC001과 DGUC003은 육안으로 관찰 가능한 크기의 다발(fascicles)을 형성하였으며, 세포사(trichome)가 병렬 형태로 나열되고, 세포사의 양쪽 끝에 위치한 말단 세포(terminal cell)가 거의 투명하거나 긴 끈 형태의 세포질을 가지고 있었다. 또한, 두 개의 균주는 98.4%의 유전적 유사도를 나타내어 동일종으로 판단되었고, 유전자 은행에서 선별한 Cluster I의 Aph. flos-aquae strains과도 계통수에서 66~82%의 bootstrap value의 지지도로 단일 cluster에 포함되었다. 확보된 두 개 균주의 유전자 정보는 유전자은행 NCBI에 등록되었으며, KY327795, KY327796의 Accession no.를 부여받았다. 한편, 세포독소 CYN의 생합성에 관여하는 유전자 cyrA와 cyrJ는 두 개 균주 모두에서 확인되지 않았다. STX의 생합성을 담당하는 유전자 중 sxtA 유전자는 두 개의 균주에서 확보되었으며, 독소생합성 과정의 분자생물학적 지표 역할을 하는 sxtI 유전자는 발견되지 않았다. 따라서 낙동강 현장시료에서 분리된 두 개의 균주는 형태학적 및 계통분류학적으로 동일종인 Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888로 동정되었으며, 두 개의 균주는 CYN과 STX의 잠재적인 독소 비생성 균주로 확인되었다. 이 결과를 통하여 Aph. flos-aquae가 독소 생성 분류군으로 분류되는 것에 대한 보다 면밀한 검토가 필요할 것으로 판단되었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권1호
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• pp.49-54
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• 2007

Ethane 1,2-dimethane sulfonate(EDS)은 Leydig cells(LC)만을 선별적 사멸을 유도하는 약물로서 가역적인 테스토스테론(testosterone, T) 결핍 흰쥐 모델을 만드는데 널리 사용된다. 본 연구에서는 수컷 흰쥐 뇌하수체의 생식소자극호르몬인 LH와 FSH의 발현에 미치는 EDS 투여 효과를 조사하였다. 성숙한 수컷 흰쥐(SD strain, $300{\sim}350\;g$ B.W.)에 EDS(75 mg/kg, i.p.)를 1회 복강주사하고 주사 후 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 그리고 7주가 경과한 날 희생시켰다. 뇌하수체로부터 total RNA를 추출한 후 뇌하수체 glycoprotein hormone common alpha subunit($C{\alpha}$), LH beta subunit($LH{\beta}$), FSH beta subunit($FSH{\beta}$) 그리고 GnRH 수용체(GnRH-R)의 발현 변화를 semi-quantitative RT-PCR로 측정하였다. 그 결과, $C{\alpha}$ 전사수준은 주사 후 1주부터 급격히 상승하여 주사 후 4주까지 유의하게 높게 유지되다가 5주 후부터 control 수준으로 회귀하였다. $LH{\beta}$ 전사 수준은 주사 후 2주부터 유의하게 상승하여 주사 후 4주에 최고 수준에 도달하였으며, 5주 후부터 control 수준으로 감소하였다. $FSH{\beta}$ 전사수준은 주사 후 2주부터 유의하게 상승하여 주사 후 3주에 최고 수준에 도달하였으며, 4주 후부터 감소하여 5주 후에 최소치를 보였다. 유사하게, GnRH-R 전사 수준도 주사 후 2주부터 유의하게 상승하여 주사 후 3주에 최고 수준에 도달하였으며, 5주 후부터 control 수준으로 감소하였다. 본 연구는 EDS 주사에 의해 수컷 흰쥐 뇌하수체 전엽에서의 생식소 자극호르몬 subunit들과 GnRH-R의 발현 변화가 가역적으로 유도될 수 있음을 보여준 것이다. EDS 주사 모델은 수컷 흰쥐에서의 시상하부-뇌하수체 신경내분비 축의 호르몬 조절에 대한 기작을 이해하는데 도움이 될 것이다.

• 한국식품과학회지
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• 제49권6호
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• pp.599-604
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• 2017

부산지역 마트 및 농산물도매시장에서 구매한 단순가공 농산물 258건 대상으로 미생물학적 오염실태를 조사하기 위해 일반 세균수 및 대장균군수를 측정하였고 이를 세 가지 기준으로 분류하여 비교하였다. 먼저 단순가공 농산물을 가공식품과 농산물로 나누어 살펴본 결과 농산물의 일반세균수 평균값이 약 2배가량 높고, 최고값 또한 약 5배나 높았다. 단순가공채소류, 건나물류, 단순가공과일류로 분류하여 ANOVA분석을 실시한 결과 매우 높은 통계적 유의차를 보였으며 단순가공채소류의 경우 일반 세균수 7.1 log CFU/g, 대장균군 4.1 log CFU/g, 건나물류의 경우 일반세균수 6.8 log CFU/g, 대장균군 3.5 log CFU/g, 단순가공과 일류는 일반세균수 6.2 log CFU/g, 대장균군 2.9 log CFU/g의 평균값을 나타내어 가식부가 토양과 가까울수록 일반세균수 및 대장균군의 오염도가 높음을 알 수 있었다. 또한 단순조리용으로 분류된 단순가공 농산물 185건 중 일반세균수가 5,000,000 CFU/g 이상인 제품은 67건(36.2%), 대장균군수가 1,000 CFU/g 이상인 제품은 43건(23.2%)이었고, 즉석섭취용 단순가공 농산물 73건 중 일반세균수가 500,000 CFU/g 이상인 제품은 32건(43.8%), 대장균 군수가 100 CFU/g 이상인 제품은 총 12건(16.4%)이었다. 식중독균 7종에 대한 오염 실태를 조사한 결과 살모넬라, 캠필로박터 제주니/콜리, 리스테리아 모노사이토제네스는 모두 음성, 황색포도알세균은 0 CFU/g으로 모두 불검출되었다. 병원성대장균의 경우 분리된 대장균 4건(1.6%) 모두 건나물류에서 검출되었고 독소유전자는 확인되지 않았으나 분변 오염 가능성을 배재할 수 없다. 클로스트리듐 퍼프린젠스는 2건(0.8%) 모두 50 CFU/g 검출되었고 독소유전자는 보유하고 있지 않았다. 바실러스 세레우스는 41건(16.3%) 검출되었으며 분리된 바실러스 세레우스 60주에 대한 1종류의 구토독소와 9종류의 장독소 유전자 확인 결과 모두 1종류 이상의 독소 유전자를 보유하고 있었으며 9종류 장독소 유전자를 모두 보유하는 경우가 15주(25%)로 가장 많았고, 구토독소는 1주(2%)가 검출되었다. 현재 유통되는 단순가공농산물은 그 형태와 범위가 방대하여 이를 모두 식품위생법으로 관리하기에는 과한 규제이며 가공 공정이나 용도 등과 같은 명확한 기준으로 농산물과 가공식품을 나누어 관리하는 것을 제안한다. 즉 즉석섭취가 가능한 다진 마늘, 절단 과일 등은 식품위생법의 가공식품으로 관리하는 등 통일된 규제가 필요하며, 세척, 가열 조리하여 섭취하는 단순가공 농산물의 경우 위생적 생산 관리, 냉장 유통, 세척 문구 표시의무화 등과 같은 구체적인 위생관리 방안을 마련하여 관리하는 것이 바람직하다.

• 미생물학회지
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• 제54권4호
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• pp.384-397
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• 2018

본 연구는 전통 발효식품에서 반려동물의 사료 및 보조식품 등에 사용될 수 있도록 안전성 확보와 프로바이오틱스 활성 등 기능성을 갖춘Bacillus 속 균주를 선발하고자 하였다. 전국에서 수집한 전통 장류에서 약 300종의 분리주를 확보하였고, Bacillus cereus가 생성하는 구토와 설사 독소 유전자 6종, ${\beta}$형 용혈성, 발암 관련 효소 3종 등을 보유하지 않거나 생성하지 않는 4종의 균주를 선별하였다. 4종의 분리주를 대상으로 항생물질 유전자 보유 여부, 세포 표면 소수성, 항생제 감수성과 당 이용성 등을 분석하였고, 최종적으로 항생물질 생성 유전자 3종을 모두 보유하고, 혈전 용해 및 세포 표면 소수성이 가장 우수한 SRCM 100731을 선정하였다. 최종 선별된 SRCM 100731의 16S rRNA 염기서열 분석 결과 Bacillus amyloliquefaciens로 동정 되었으며, 펫 사료 및 식품 등 산업적 적용을 위하여 균체 성장 최적화를 수행하였다. SRCM 100731의 배지 성분 선별을 위하여 Plackett-Burman design (PBD)을 사용하였으며, 최적 성장을 위한 배지 성분으로는 molasses와 sodium chloride, potassium chloride가 예측되었다. PBD를 통해 선정된 배지 성분의 농도를 최적화하기 위하여 central composite design (CCD)을 사용하였으며, 실험 결과 7.0% molasses, 1.1% sodium chloride, 0.5% potassium chloride로 예측되었다. 이때 최대 균체량은 12.6625 g/L로 예측되었으며, 최종적으로 실험 모델의 예측값과 실 측정값이 $12.6625{\pm}0.0658g/L$로 오차 범위내의 결과를 나타내어 실험 모델의 신뢰성을 검증할 수 있었다. 이는 실험 모델에 의해 예측된 최적 배지 사용 시 최적화 이전 배지에서의 균체량($1.8273{\pm}0.0214g/L$) 대비 약7배로 균체량이 증가함을 확인할 수 있었다. 향후 B. amyloliquefaciens SRCM 100731의 제품 개발 등 후속 연구의 진행이 필요하나 본 연구를 통해 산업 적용이 가능한 프로바이오틱스 소재의 발굴 및 산업화 배양 조건이 확립 되었으므로 앞으로 성장하고 있는 반려동물 산업에 유용하게 활용 될 수 있을 것으로 기대된다.