• Journal of Microbiology
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• 제34권4호
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• pp.355-362
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• 1996

Complementation cloning of the argC, E, B, D, F, and G genes in Corynebacterium glutamicum was done by transforming the genomic DNA library into the corresponding arginine auxotrophs fo Escherichia coli. Recombinant plasmids containing 6.7 kb and 4.8kb fragments complementing the E. coli argB mutant were also able to complement the E. coli argC, E, A, D, and F mutants, indicating the clustered organization of the arginine biosynthetic genes within the cloned DNA fragments. The insert DNA fragments in the recombinant plasmids, named pRB1 AND pRB2, were physically mapped with several restriction enzymes. By further subcloning the entire DNA fragment containing the functions and by complementation analysis, we located the arg genes in the order of ACEBDF on the restriction map. We also determined the DNA nucleotide sequence of the fragment and report here the sequence of the argB gene. When compared to that with the mutant strain, higher enzyme activity of N-acetylglutamate kinase was detected in the extract of the mutant carrying the plasmid containing the putative argB gene, indicating that the plasmid contains a functional argB gene. Deduced amino acid sequence of the argB gene shows 45%, 38%, and 25% identity to that from Bacillus strearothermophilus, Bacillus substilus, and E. coli respectively. Our long term goal is genetically engineering C. glutamicum which produces more arginine than a wild type strain does.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권4호
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• pp.789-795
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• 2004

A promoter-probe shuttle vector pSK1Cat was constructed for the isolation of transcriptional signal sequences from Corynebacterium glutamicum. Besides conferring resistance to kanamycin in Escherichia coli and C. glutamicum, the vector carried a promoterless cat gene to confer resistance to chloramphenicol upon insertion of the appropriate transcriptional signals in the multiple cloning site. By utilizing the vector, a series of transcriptionally active fragments were isolated from the genome of C. glutamicum. The clones, ranging from 200 bp to 1 kb in size, were grouped into 3 classes of strong, medium, and weak, based on the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) activity and sensitivity to the chloramphenicol of the clone-carrying C. glutamicum cells. C. glutamicum cells carrying the $P_{19}$ clone, a representative in the strong class, were able to grow on minimal agar plates containing over $40 mg/mell$ chloramphenicol, and showed CAT activity of 10 m㏖/mgㆍmin, performing slightly better than the cells carrying $P_{tac}$ , a strong E. coli promoter. Subcloning analysis of the $P_{19}$ clone identified a 180 bp intergenic fragment ($P_{180}$), which was located upstream of a gene encoding a hypothetical membrane protein. The expression conferred by $P_{180}$ was not affected by either the kinds of carbon sources or changes in temperature. These properties make the $P_{180}$ clone useful for the deregulated expression of biosynthetic genes in C. glutamicum during amino acid fermentation.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권3호
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• pp.219-223
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• 1986

사람 선유아세포 인터페론의 정제에 사용되는 단 clone성 항체생산 세포주를 조작하기 위하여 BA-LB/C mouse의 복강과 꼬리정맥을 통하여 HuIFN-$\beta$를 면역화시키고 그 비장세포(spleen cells) 와 NS-O 세포주를 세포융합 시켰다. 융합된 1300 hybrids를 ELISA방법으로 선별하고 soft agarose 방법과 limiting dilution방법으로 subcloning하여 높은 항체를 생성하는 것으로 판명된 11 hybrids를 재선별 하였다. 재선별된 11 hybrids 각각의 항체형 (Ig type)을 조사하고 최종 Protein A-sepharose와 친화성이 높은 IgG 2a/형의 clone # 4-1-19와 clone # 551-4-1을 선별하여 배양된 세포를 각각 nude(nu/nu) mouse 및 BALB/c mouse 복강에 접종배양 하였다. 이들 mouse복강액으로 부터 얻은 ascites fluid를 protein A-sepharose를 이용한 affinity column분획으로 항체를 정제하였으며 ascites fluid $m{\ell}$당 약 4mg의 정제된 항체를 얻을 수 있었고 SDS-polyacrylamide gel상에서 전기영동 시킨 결과 분자량 14-16만 dalton으로 추정되는 항체를 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제14권2호
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• pp.315-319
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• 2004

사람의 serine palmitoyltransferase(SPT, EC 2.3.1.50)에 대한 항체를 제작하기 위하여 E. coli발현 vector인 pRset vector에 SPTLC1 및 SPTLC2 유전자를 subcloning하고 BL21 (DE3)pLys cell에 발현시켰다. 포유동물의 SPT는 원핵세포의 SPT homodimer와는 달리 SPTLC1 및 SPTLC2 2개의 sub-unit로 된 heterodimer이다. Human embryo kidney cell인 HEK293 cell의 total RNA로부터 RT-PCR을 행하여 cDNA library를 얻은 다음 SPTLC1 및 SPTLC2의 특이적인 primer 들을 이용하여 PCR을 행하였다. SPTLC1 및 SPTLC2 DNA를 hexahistidine fusion 단백질을 발현시킬 수 있는 pRset vector에 cloning하여 pRsetB/SPTLC1 및 pRsetA/SPTLC2를 얻고 염기서열을 확인하였다. 재조합 plasmid를 발현세포인 BL21 cell에 형질전환시킨 다음 ampicillin 및 chroramphenicol 배지에서 선별하여 재조합세포를 얻었다. 1 mM IPTG로서 발현을 유도하였으며 세포 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 다음 His-tag antibody로 western blotting을 행하여 SPTLC 및 SPTLC2가 발현되었음을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권3호
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• pp.215-221
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• 1991

YIp5를 사용하여 Cephalosporium acremonium ATCC 2033으로부터 Saccharomyces cerevisiae SHY3에서 발현되는 자율복제 기점 (ARS)를 분리하였다. 자율복제 기점을 갖는 40종의 vector 가운데 가장 안정성 (stability)이 높은 plasmid를 pCY-2라 명명하였으며 pCY-2는 C.acremonium에서 유래하는 3.7kb의 단편을 갖고 있었다. 또 Southern hybridization과 재형질전환을 통해 pCY-2가 효모내에서 자율적으로 복제되고 있다는 것을 확인하였다. 또한 pCY-2는 형질전환율과 안정성에 있어 효모의 ARS를 갖는 YRp7 vector보다 우수하였다.

• 약학회지
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• 제39권2호
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• pp.161-168
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• 1995

Brain dopamine systems play a central role in the control of movement, hormone release, and many complex behavior. The action of dopamine at its synapse is terminated predominately by high affinity reuptake into presynaptic terminals by dopamine transporter (DAT). The dopamine transporter(DAT) is membrane protein localized to dopamine-containing nerve terminals and closely related with cocaine abuse, Parkinsonism, and schizophrenia. In present study, the recombinant plasmid pRc/CMV-DAT, constructed by subcloning of a cDNA encoding a bovine DAT into eukaryotic expression vector pRc/CMV, was stably transfected into CV-1 cells(monkey kidney cell line). The DAT activities in the cell lines selected by Geneticin$^{R}$ were determined by measuring the uptake of $[^3H]$-dopamine. The transfected cell lines showed 30-50 fold higher activities than untransfected CV-1 cell line, and this result implies that DAT is well expressed and localized in transfected cells. The transfected cells accumulated $[^3H]$-dopamine in a dose-dependent manner with a $K_{m}$ of 991.6nM. Even though high doses of norepinephrine, epinephrine, serotonin, and choline neurotransmitters inhibited the uptake of $[^3H]$-dopamine, DAT in transfected cell line was proven to be much more specific to dopamine. The psychotropic drugs such as GBR12909, CFT, normifensine, clomipramine, desipramine, and imipramine inhibited significantly the dopamine uptake in tissue culture cells stably transfected with DAT cDNA. Radioactive in situ hybridization was done to map the cellular localization of DAT mRNA-containing cells in the adult rat central nervous system. The strong hybridization signals were detected only in the substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area. The restricted anatomical localization of DAT mRNA-containing cells confirms the DAT as a presynaptic marker of dopamine-containing cells in the rat brain.

• 한국초지조사료학회지
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• 제17권3호
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• pp.285-292
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• 1997

This study was conducted to obtain the transgenic Brnssica napus plants with tobacco Apase gene using the binary vector system of Agrobacteriurn fumefociens. The results obtained were summarized as follows: A repressible acid phosphatase gene of Saccharon~yces cerevisiae, pho105 was used for screening of tobacco Apase cDNA. In order to identify Apase gene in tobacco genome, Southern blot analysis was pcrformed and the Apase gcnc may be present as a single copy, or at most two or three copies, in tobacco genome. To isolate the tobacco Apase gene, tobacco cDNA library was constructed using purifed mRNA from -Pi treated tobacco root and the plaque forming unit of the library was 2.8 x $10^5$ pfu/m${\ell}$, therefore the library might cover all expressed mRNAs. Using pho5 as a probe. tobacco Apase cDNA was cloned, and restriction mapping and Southern blot analysis of cDNA insert were revealed that the 3.6 kb cDNA contained tobacco acid phosphatase cDNA. Plasmid pGA695 -tcAPl was constructed by subcloning tobacco Apase cDNA into the Hind site of pGA695 with 35s promoter which can be expressed constitutively in plants. The Brassica napus cotyledonary petioles were cocultivated with the ,4 grobacteriunz and transferred to the selection medium. The transformed and regenerated plants were transplanted to soil medium. Southern blot analysis was done on the transformed plants, and it was confirmed that a foregin gene was stably integrated into the genonies of B. nnpus plants.

• 미생물학회지
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• 제28권3호
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• pp.192-198
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• 1990

플라스미드 pKM101과 이의 돌연변이제 pSLA의 mutator 유전자를 subcloning하여 재조합 플라스미드 pJB200과 pJB210을 선별하였고, umuC36- uvrA6-(TK 610) 균주에 도입하여 UV와 MMS에 대해서 보호효과와 돌연변이율에 미치는 영향을 조사하였다. 재조합된 플라스마드는 UV와 MMS에 대해서 nonmutability인 umu- 균주에서 완전히 돌연변이율을 회복시켰고 보호효과를 크게 증가시켰다. 이 사실은 muc 유전자가 cloning된 재조합 플라스미드가 돌연변이원의 처리에 의해 효과적인 발현을 하며, muc 유전자 만으로도 pKM101의 기능을 나타낸다는 것을 확인하였고, pSLA의 muc 유전자가 그 효과에 었어서 높은 영향을 미쳤다. 또한 pKM101의 muc gene을 포함한 pJB210 은 recA - (JC2926) 균주에서 돌연변이 유발능에 영향을 미치지 못한 것은 muc 유전자가 recA 유전자에 의존함을 알 수 있었다.

• 한국균학회지
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• 제22권3호
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• pp.247-253
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• 1994

본 연구는 고등균류중 담자균류에 속하는 치마버섯에 있어 자실체 형성을 직접적으로 조절하는 mating locus의 분리 및 특성을 규명하고자 하였다. 북미 자생의 치마버섯 UVM 1-34 균주로부터 $A{\alpha}3$ allele 분리를 위하여 만든 genomic library의 전체 숫자는 약 $2{\times}10^4$ cells로서 이중 약 90%가 약 35kb의 inserted DNA를 가진 것으로 나타났으며, colony 및 southern hybridization을 통해 얻은 6개의 clone 모두가 mating activity를 나타내었다. 이 중에서 1개 clone을 선정하여 남미자생의 UVM 1-71 $A{\alpha}3$ allele의 Z, Y region을 포함하는 5.7kb의 단편을 pBluescript ll KS(+)에 subcloning 시켜 trp1 gene 함유의 pTC20 cosmid와 함께 cotransformation 시킨 결과 약 50%의 clamp cell 형성을 보임으로서 이 clone이 mating activity를 가지는 것으로 나타났다.

• 식물조직배양학회지
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• 제27권3호
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• pp.169-173
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• 2000

Amaranthus hypochondriacus의 저장 단백질을 encoding 하는 AmA1 유전자를 RT-PCR 방법을 이용하여 분리하고 특성화하였다. AmAl 유전자를 담배에 형질전환 시키기 위해 CaMV 35S promoter와 3'NOS를 가지고 있는 식물 발현 vector에 subcloning 하고 이 재조합 vector를 이용하여 Agrobacterium-mediated형질전환 방법을 이용하여 담배에 도입시켰다 신초는 0.1 mg/L NAA, 1.0 mg/L BA, 100 mg/L kanamycin 그리고 250 mg/L cefotaxime이 첨가된 MS 선발 배지에서 선발했고, 선발된 신초는 식물 생장 조절제를 첨가 하지 않고 200 mg/L kanamycin과 250 mg/L cefotaxime이 첨가된 MS배지에서 뿌리를 유도하였다. 선발된 담배의 게놈내의 AmA1 유전자의 존재는 PCR 방법과 hybridization을 이용하여 확인되었고, AmA1 유전자의 발현은 RT-PCR방법과 Southern blot hybridization을 사용하여 확인되었다.