A highly specific antigenic protein of 31 kDa from plerocercoid of Spirometra mansoni (sparganum) was obtained by gelatin affinity and Mono Q anion-exchange column chromatography. The purified 31 kDa protein was subjected to N-glycan enzymatic digestion for structural analysis. The relative electrophoretic mobility was analyzed by SDS-PAGE, before and after digestion. On SDS-PAGE after enzymatic digestion, the 31 kDa protein showed a molecular shift of approximately 2 kDa, which indicated the possession of complex N-linked oligosaccharides (N-glycosidase F sensitive) but not of high-mannose oligosaccharides (endo-beta-N-acetylglucosaminidase H, non-sensitive). Chemically periodated 31 kDa protein showed statistically non-significant changes with human sparganosis sera by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Therefore, the dominant epitopes of the 31 kDa molecule in human sparganosis were found to be mainly polypeptide, while N-glycans of the antigenic molecule in sparganum was minimal in anti-carbohydrate antibody production.
Human sparganosis is a food-borne parasitic disease caused by the plerocercoids of Spirometra species. Clinical diagnosis of sparganosis is crucial for effective treatment, thus it is important to identify sensitive and specific antigens of plerocercoids. The aim of the current study was to identify and characterize the immunogenic proteins of Spirometra erinaceieuropaei plerocercoids that were recognized by patient sera. Crude soluble extract of the plerocercoids were separated using 2-dimensional gel electrophoresis coupled with immunoblot and mass spectrometry analysis. Based on immunoblotting patterns and mass spectrometry results, 8 antigenic proteins were identified from the plerocercoid. Among the proteins, cysteine protease protein might be developed as an antigen for diagnosis of sparganosis.
We purified specific 31/36 kDa antigenic molecules from sparganum in different intermediate hosts (snakes and mice) and analyzed their monosaccharide compositions. Compositional analysis showed that glucose and man nose concentrations were 2-3 fold higher in the 31/36 kDa molecule purified from snakes than those from mice. This result implies that antigenic glycoproteins of sparganum from snakes might be modified in mammalian sparganosis with respect to their carbohydrate composition.
After infection of male mice with the plerocercoids (spargana) of Spirometra mansoni, serum levels of estrogen and testicular weight were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and weighing machine, respectively. The serum level of estrogen increased progressively in infected mice compared with normal controls, whereas the testicular weight of infected mice decreased significantly (P < 0.05). These results suggest that certain substances from spargana change the steroid hormone metabolisms in the host by unknown pathways, and chronic infection may contribute to change of the function of steroid hormone target organ, i.e., testis, in male mice.
Chinese edible frogs, Hoplobatrachus rugulosus, were examined to estimate the potential risks of human gnathostomiasis and sparganosis in Myanmar. A total of 20 frogs were purchased in a local market of Yangon and examined with naked eyes and the artificial digestion method after skin peeling in June 2018 and June 2019. Larvae of gnathostomes and Spirometra (=spargana) were detected in 15 (75.0%) and 15 (75.0%) frogs with average intensities of 10.5 and 6.3 larvae per infected frog, respectively. Gnathostome larvae were 2.75-3.80 (av. 3.30) mm long and 0.29-0.36 (0.33) mm wide. They had a characteristic head bulb with 4 rows of hooklets, a muscular long esophagus, and 2 pairs of cervical sac. The mean number of hooklets were 41, 44, 47, and 50 on the 1st, 2nd, 3rd, and 4th row, respectively. Collected spargana were actively moving, particularly with the scolex part, and have ivory-white color and variable in size. Conclusively, it has been first confirmed that Chinese edible frogs, H. rugulosus, are highly infected with larval gnathostomes and spargana in this study. Consuming these frogs is considered a potential risk of human gnathostomiasis and sparganosis in Myanmar.
스파르가눔증(sparganosis)은 Spirometra의 plerocercoid 유충이 인체에 감염되었을 때 유발되는 질병으로 국 내에서 드물지 않게 관찰되는 조직내 기생 윤충중이다. 이 연구에서는 마우스에 실험적으로 피하 스파르가눔중을 만들고 경시적으로 병변의 조직학적 소견의 변화와 효소면역법에 의한 혈청 항체가를 관찰하여 이 질병의 병소 형성 과정을 관찰하였다. 뱀에서 얻은 충체를 5마리씩 마우스에 경우 감염시키고, 1,24 및 10주와 6개월 후에 도살하여, 충체의 분포와 수를 육안으로 확인하고 피하 감염부위를 조직표본으로 만들어 현미경으로 관찰하였다. 이와 동시에 효소면역 법을 이용하여 혈청 내 항스파르가눔 IgG 항체가를 측정하여 아래의 결과를 얻었다. 1. 충체 회수울은 감염 후 1주와 2주에 각각 80% 이었으나 조금씩 증가하여 6개월에는 100%이고, 전체 평균 88.3%가 회수되었다. 충체의 대부분은 목파 몸통의 피하조직에서 검출되었고 피하조직에서 골격근에까지 침범 한 것도 일부 관찰되었다. 감염 기간이 경과할수록 충체가 성장하여 고 무게가 처음에 평균 7.3 mg에서 6개월 후에는 47.1 mg으로 증가하였다. 감염기간과 충체의 분포와는 차이가 없었다. 2. 감염 후 1주와 2주에 충체 주위에 염증세포가 국한되어 소수 관찰되었으나, 충체가 지라간 부위로 추측되 는 곳에 많은 세포가 관찰되기도 하였다. 감염 4주 이후에는 충체가 있는 조직 내의 공간 주위로 파괴된 조직세 포와 중성구, 호산구, 림프구등의 염증세포가 많이 침윤되어 있고, 일부에서 삼출액도 관찰되었다. 감염 후 4주 와 10주에는 충체와 이에 인접한 염중세포층의 주위를 조직구(histiocytes)와 섬유다세포가 충을 이루어 둘러싸고 있었다. 감염 후 6개월에 관찰한 바, 대부분의 충체 주위에서 염증세포가 줄고 섬유소에 의한 충낭(worm capsule)이 얇게 형성되어 있었다. 그러나 이 때에도 충체 주위에 농양을 만들거나 심한 염증소견을 보인 부분도 있었다. 모든 감염 군에서 충체는 형태학적으로 온전하고 칼슘 과립을 갖고 있었다. 3. 혈칭 내 IgG 항체가는 평균 흡광도가 감염 후 1주에 0,108, 2주에 0.141이었으나 4주에 0.456, 10주에 0.955, 6개원에 1.060으로 증가하였다. 이상의 결과를 종합하면 스파르가눔 감염 추 4주가 경과하면 염증반응이 강하게 나타나고, 조직구와 섬유세 포가 관찰되기 시작하며, 혈청 내 IgC 항체가도 유의하게 증가함을 알 수 있었다. 충체가 이동하지 않을 경우에 약 10주가 경과하면 충체 주위에 섬유소가 증식하여 충낭을 형성하고 이 기간 이후에는 항체가의 증가도 완만 하였다.
The author reported previously on separation of the outer tegument of the spargana (plerocercoids of Spirometra mansoni) using high concentration of urea solution. To determine which layer of the tegument is separated by this method, an electron microscopic analysis has been processed in this study. It was confirmed that the basement layer of the tegument is separated from the parenchyme of the sparganum. In addition, the antigenicity of the separated outer tegument against the human sparganosis patient sera was evaluated. Numerous antigenic proteins, including 16 and 55 kDa proteins, were noticed in the separated tegument; however, there were no diagnostic 31/36 kDa molecules in this tegument. The molecules reactive with the patient sera in the tegument are to be characterized in future studies.
Diagnostic specificity of 36 and 91 kDa proteins of Spirometra erlnacei plerocercold (sparganuml was evaluated by micro-ELISA In tissue Invading nematodiasls such as 25 gnathostomiasis, 33 angiostrongyllasls, 22 trichlnellosis patients, and 20 normal control. All but one patient each in 3 nematodlases showed the antibody levels of negative range. The positively reacted patients were regarded as concomitant Infections of sparganum because Immunized or hypennfected rabbit sennn of the nematodes did not react crossly to the antigen.
고양이 두개강 내에 주입된 스파르가눔의 형태와 운명을 파악하고 숙주의 항체형성 양상을 관찰하고자 102마리 의 스파르가눔을 22마리의 고양이의 뇌실질 내에 주입하고 2주, 1개월, 3개월, 6개월 후에 도살하여 충체의 희 수율 및 분포를 육안으로 확인하였고 스파르가눔 감염전, 감염후 1주, 2주, 1개월, 3개월, 6개월의 뇌척수액을 얻어 효소면역 법 (ELISA)을 이용하여 시G 항체가를 측정하여 다음의 결과를 얻었다. 1. 부검을 시행한 고양이 22마리 중 17마리에서 충체가 회수되었고, 뇌에 주입한 충체 총 102마리 중 43마리(42%)를 회수하였다. 충체의 두개강 내 분포는 경막하 또는 지주막하 공간에서 19마리(44%)가 검출되어 가장 많았고, 다음으로 뇌실질 내 16마리(37%), 측뇌실 내 2마리(5%)의 순이었다. 두개골의 판간층(diploic space)에 위치한 것이 1마리(2%)이었으며 두개골 외에서도 5마리(12%)가 관찰되었다. 이들 충체는 한 마리를 제외하고 모두 생존하고 있었으며 상당히 성장하여 있었다. 뇌에서 충체의 분포는 특별한 편중이 없이 전 부위에서 고르게 관찰되었고 척수에서는 검출되지 않았다. 2. ELISA를 이용하여 측정한 뇌척수액 내 IgG 항체가는 감염후 1개월부터 양성기준치 이상으로 증가하기 시작하여 감염후 3개월에는 현저하게 증가되었다. 고양이를 이용한 실험적 두개강 내 스파르가눔증은 주입한 충체의 약 400A 정도가 두개강 내에서 회수되므로 몇가지의 제약에도 불구하고 이 질병의 연구에 유용한 모델로 판단된다.
조직기생충증인 스파르가눔증은 우리 나라를 비롯하여 동양 여러 나라에서 드물지 않게 발생하고 있으므로 보조진단법으로서 쳔청학적 진단이 필요하다. 그러나, 현재 진단에 사용하는 항원인 스파르가눔의 생리식염수 추출액은 그 단백질 구성이 복잡하고, 낭미충중, 포충증, 폐흡충증 등과 혈청학적 교차반응을 일으키는 경우가 있어 개선의 여지가 많다. 이 실험은 스파르가눔 생리 식염수 추출액의 구성단백질 중 항원성이 높고, 교차반응이 적은 구성단백질 분회만을 단세포군항체를 이용하여 친화성 크로마토그래피로 분리하고 그 항원성을 평가하고자 하였다. 먼저 Sephacryl S-300 Superane을 통과시켜 스파르가눔 생리 식염수 추출액을 5 분획으로 나눈 결과, 분자량이 90kDa 이상으로 구성된 제1, 2 분획은 항원성은 높았으나 교차반응을 많이 일으키고 있었다. 제 3분획 의 주요 구성성분은 스파르가눔증 환자 혈청과의 SDS-PAGE/EITB를 통해 가장 민감한 반응을 보였던 36, 29 kDa 단백질이었다. 이어 스파르가눔 추출액으로 면역시킨 BALB/C mice 비장세포에서 기린한 단세포군항체 중 36,29 kDa에 반응하는 단세포군항체를 리간드로 친화성 크로마토그래피를 실시하여 36, 29 kDa 단백질을 순수하게 분리하였다. 이 두 단백질은 같은 항원결정 기를 지니고 있는 것으로 판단하였다. 순수분리한 항원의 항원성을 스 파르가눔 감염자 28명과 기타 질환자 및 건강 대조군 99명의 혈청으로 평가한 결과, 이 항원은 조항원(스파르가눔 추출액)에 비해 민감도는 같았으나(96.4%) 특이도는 86.8%에서 96.9%로 개선되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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