• 한국미생물·생명공학회지
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• 제15권2호
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• pp.129-134
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• 1987

Snake venom proteinase에 대한 저해물질을 생성하는 Aspergillus 속 균주 MK-24를 토양으로부터 얻어 그 배양액에서 저해물질을 분리하여 Venom proteinase에 대한 작용양상과 안정성에 대한 조사결과는 다음과 같다. Glucose 2%, NaNO$_3$ 0.3%, $K_2$HPO$_4$ 0.02%, MgSO$_4$ㆍ7$H_2O$ 0.02%, KCl 0.02% 조성의 배지(pH 5.0)를 사용하여 3$0^{\circ}C$에서 7일간 배양하여 얻은 배양액을 acetone 심전 활성탄, methanol 침전으로 무정형의 유효분말을 얻었다. 이 물질은 A. b.b. venom proteinase에 대하여 1/2 배양에서 약 70% 저해율을 나타냈으며, A.b.b. venom proteinase에 대한 저해양상을 혼합형이었으며 enzyme-inhibitor complex를 형성하는데 20분 정도가 걸렸다. 반응액중에 Co$^{++}$, $Zn^{++}$, Cu$^{++}$ 등이 존재하면 저해작용이 완전히 억제되었다. 저해율은 사용한 기지리의 종류에 따라 차이가 났다. 즉 casein을 사용했을 때는 hemoglobin이나 albumin보다 저해율이 높았다. 그리고 본 저해물질은 snake venom proteinase 이외에 trypsin에 고농도에서 약간 저해작용을 나타냈으나 pepsin, $\alpha$-chymotrypsin, papain 등과 탄수화물 가수분해효소 등에는 저해능이 없었고, 혈액응고에 대하여는 1.6 $\mu\textrm{g}$/2$m\ell$ 농도 이상에서는 저해작용을 나타내었다. 본 저해물질은 열이나 pH에 대한 안정성이 컸다. 즉, pH처리에 대해서는 37$^{\circ}C$에서 60분 처리로 산이나 alkali에 대해서 대단히 넓은 범위에 걸쳐서 안정하였으며 $65^{\circ}C$에서는 중성까지는 안정하였으나, pH 8 이상에서는 불안정하였고 열처리에 대해서는 10$0^{\circ}C$에서 2시간 처리했을 때에도 잔존활성도가 약 90%로 매우 안정하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제15권2호
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• pp.135-139
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• 1987

Aspergillus 속 균주 MK-24로부터 venom proteinase inhibitor의 생산조건을 검토한 결과 질소원으로서는 유기능질소가 균생육에 있어서는 매우 좋았으나 물질생성에 있어서는 무기능질소보다 못하였다. 무기질소원으로서는 sodium nitrate가 가장 좋은 효과를 보였다. 단소원으로서는 glucose가 대부분 당류와 비슷한 결과를 나타내었고 특히 arabitol, xylitol, salicin 등은 본 균주가 단소원으로 사용치 못하는 것으로 추정되었으며, vitamin 류는 물질생성에 무관하였으며 금속염류로서는 효과적인 것은 없으나, Ag$^+$, Co$^{++}$, $Zn^{++}$ 등은 억제하였다. 배양온도와 pH는 각각 3$0^{\circ}C$와 pH 5가 균의 생육과 저해물질생성에 제일 적당하였고, 단소원과 질소원으로서 glucose 2%, NaNo$_3$ 0.3%을 가한 액체배지에서 7일간 정치배양 하였을 때 저해물질생육이 가장 좋았다.

• 대한약침학회지
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• 제16권2호
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• pp.46-54
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• 2013

Objective: This study was undertaken to isolate a fibrin(ogen)olytic enzyme from the snake venom of Gloydius blomhoffii siniticus and to investigate the enzymatic characteristics and hemorrhagic activity of the isolated enzyme as a potential pharmacopuncture agent. Methods: The fibrinolytic enzyme was isolated by using chromatography, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, and fibrin plate assay. The characteristics of the enzyme were determined by using fibrin plate assay, protein hydrolysis analysis, and hemorrhage assay. Its amino acid composition was determined. Results: The fibrin(ogen)olytic enzyme with the molecular weight of 27 kDa (FE-27kDa) isolated from G. b. siniticus venom consisted of two heterogenous disulfide bond-linked polypeptides with the molecular weights of 15 kDa and 18 kDa. When more than $20{\mu}g$ of FE-27kDa was applied on the fibrin plate, fibrinolysis zone was formed as indicating its fibrinolytic activity. The fibrinolytic activity was inhibited completely by phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and partially by thiothreitol and cysteine. Metal ions such as $Hg^{2+}$ and $Fe^{2+}$ inhibited the fibrinolytic activity completely, but $Mn^{2+}$ did not. FE-27kDa preferentially hydrolyzed ${\alpha}$-chain of fibrinogen and slowly hydrolyzed ${\beta}$-chain, but did not hydrolyze ${\gamma}$-chain. High-molecular-weight polypeptides of gelatin were hydrolyzed partially into polypeptides with molecular weights of more than 45 kDa. A dosage of more than $10{\mu}g$ of FE-27kDa per mouse was required to induce hemorrhage beneath the skin. Conclusion: FE-27kDa was a serine proteinase consisting of two heterogeneous polypeptides, hydrolyzed fibrin, fibrinogen, and gelatin, and caused hemorrhage beneath the skin of mouse. This study suggests that the potential of FE-27kDa as pharmacopuncture agent should be limited due to low fibrinolytic activity and a possible side effect of hemorrhage.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권2호
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• pp.145-153
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• 1986

본 연구에서는 토양으로부터 분리한 Aspergillus 속의 한 균주가 Colubridae과 독사의 사독 주성분인 출혈독을 강하게 불찰성화 시키는 물질을 생성하므로 이 물질을 분리한 후 부분적으로 정제하여 결정이 형성됨을 확인하였다. 본 물질은 Colubridae과의 Agkistrodon bromohoffi brevicaudus, A. saxatilis, Trimersurus flavoviridis, A. acutus 사독의 출혈독을 정량적으로 불활성화 시키며, 최대 저해률은 80-90%에 이르며 실험한 대상 동물에 따라 활성차이가 다소 있음이 인정되었다. 예로서 병아리 피하반응에 있어서는 T. flavoviridis 사독을 동량의 시료로서 처리하였을 때 완전히 출혈활성이 저해되나 mouse 족도 조직내 반응에서는 사독의 8배량의 시료로서 출혈활성이 거의 저해되었다. 또 본 시료는 출혈독이 지니고 있는 치사활성에 있어서도 독량의 약 3배량의 시료에 의해서 거의 치사 활성을 저해하며, T. flavoviridis 사독의 HR-I 및 HR-II부종활성에 대해서는 본 물질의 1/2량 이상의 농도에서는 시료농도에 관계없이 약 50% 정도로 저해하는 반면 A. bromohoffi brevicaudus 전독의 부종은 거의 완전히 저해하였다. 사용 균은 2종의 항출혈성 물질을 생성하고 있음이 가면피내 반응에서 확인되었다.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1995년도 춘계학술대회
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• pp.114-114
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• 1995

이 연구에서는 혈전증 치료에 사용되는 혈전 응해제를 국내 독사독으로부터 개발하기 위한 실험을 실시하였다. 그 내용을 요약하면 다음과 같다. 국내에 서식하는 독사인 Agkistrodon blomoffi brevicaudus, Agkistrodon caliginosus와 Agkistrodon saxatilis에서 각각 사독을 채취하여 fibrin plate 방법으로 fibrin 분해능을 조사하여 Agkistrodon blomoffi brevicaudus의 독이 분해능이 가장 우수함을 밝혔다. 이와 같은 사실에 기초하여 A. blomoffi brevicaudus의 독으로부터 p-Aminobenzamidine affinity chromatography와 DEAE ion-exchange chromatography를 이용하여 분자량이 50.8 kDa인 황성 단백질을 정제하였다. 위에서와 같은 방법으로 정제한 단백질은 fibrin 분해능이 우수하고 fibrinogen의 ${\gamma}$ chain은 분해하지 않으나 B$\beta$ chain을 $A\alpha$ chain에 비하여 보다 선택적으로 분해하는 단백분해 효소임을 증명하였다. 이 정제 효소의 Fibrin에 대한 분해능은 266$\mu\textrm{g}$/${\mu}\ell$의 농도에서 Plasmin 1.0 unit (=3.0 WHO unit)보다 높게 나타났다. 정제된 효소는 chromogenic substrate인 N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-pNA와 N-p-Tosyl- Gly-Pro-Arg-pNA의 arginine carboxyl side를 분해하고 pH 7.5에서 최대 활성을 보이며, Vmax는 5.46 umo1/1ㆍmin이고, Km 값은 0.20mM이며, 그리고 Cu$^{2+}$, $Zn^{2+}$, soybean trypsin inhibtor에 의해 25～50% 정도, serine proteinase inhibitor인 phenylmethylsulfonyl floride에 의해 80%정도 활성이 억제되는 특성이 있음을 규명하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제7권2호
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• pp.75-89
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• 1979

사독은 단백성물질이며 그 작용은 효소적이다. 동물에 대한 강력한 작용은 독사교상의 치료에 있어서 중요한 문제점을 가지고 있다. 독사에 대한 항혈청의 개발은 오래 전부터 이루어 졌으며 근년에 와서는 거의 완성된 상태라고 생각한다. 그러나 이러한 형편에서도 항혈청에 지니고 있는 몇가지의 결점으로 인하여 유효한 화학치료제의 개발이 요구되고 있다. 그러나 사독의 다양성을 고려할 때 획일적인 치료제를 얻기란 매우 곤란할 것으로 생각된다. 사독을 화학물질로써 불활성화 시키려는 시도는 많아서 chelate 성 물질 thio 화합물, 혹종의 Amino acid, Tannic acid 등 단백질 응고제 등 시험관내에서는 강력히 작용하는 물질이 많이 발견되었으나 이들의 작용은 사독에 대해서 비특이적이며 또한 생체내에서의 작용이 강하여 그의 이용에 많은 제한이 있다. 저자들은 미생물로부터 사독에 대한 조해물질의 검색을 시도했던바 Penicillium 속의 한균주로 부터 유효한 물질을 얻을 수 있었으며 이것을 ISV-33이라 명명하였다. 이 물질은Agkistro-don 및 Trimeresurus 류 사독의 Proteinase와 출혈인자 및 치사인자에 잘 작용하여 이것들을 불활성화시키나 일반효소에는 거의 작용하지 않았다. 이 물질은 사독에 대해서 $\frac{1}{4}$~$\frac{1}{8}$ 량으로서 충분히 작용하나 그 자체의 독성은 위를 대상으로 실험했을 때 거의 나타나지 않는다. 또 이 물질은 사독에 대해서 특이성이 강하며 in vivo에서도 작용한다. 이 물질은 결정성이며 열수에는 용이하게 용해하나 명수나 명종 유기용매에는 거의 용해하지 않으며 단지 Ethylacetate에는 약간 용해한다. mp는 222$^{\circ}C$에서 승화하며 분자량 약 392인 Tetra carboxylic acid로 동정되었다 분자식은(C$_{8}$ $H_{6}$N $O_{5}$)$_2$라고 인정되며 이 물질은 Polycarboxylic acid 이므로 chelate 작용이 있을 가능성이 있으나 금속효소에 대해서는 일률적으로 작용하지 않음으로 사독의 불활성화에 있어서 chelate 작용에 인한 것은 아니라고 생각된다. 그 구조식은 아직 확정하지는 못하였으나 지금까지의 실험결과로서 cyclo hexane을 골격으로 하고 여기에 Epoxy group와 caborxyl 기가 있는 것으로 추정된다. 또 이 물질은 산, Alkali, 가열등에 대해서 매우 안정한 것으로 나타났다. 이 연구의 일부는 문교부 연구조성비(1978년도)에 의해서 수행되었다.