• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권6호
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• pp.545-551
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• 1989

알칼리성 Bacillus속 8-16 균주의 내열ㆍ알칼리성단백질 분해효소를 정제하여 그 특성을 조사하였다. 본 균주의 알칼리성 protease를 아세톤침전, CM-셀룰로즈크로마토그래피, Sephadex G-100 및 G-75 젤 여과법으로 정제하였고 비활성이 37배되게 하여 단일단백질이 될 때까지 순수정제하였다. 이 효소는 7$0^{\circ}C$ pH 11에서 pH 12 사이에서 최대 활성을 나타냈고 6$0^{\circ}C$에서는 한시간 동안 안정하였다. 이 효소의 $K_m$치는 1.3mg/$m\ell$이며 분자량 33,000으로 추정된다. 또한 이 효소는 Cu$^{2+}$ 및 Mn$^{2+}$에 의해서 약간 활성화되고 Ag$^+$, Hg$^{2+}$ 및 PMSF에 의해서 저해되므로 활성부위에 serine기가 관여하는 것으로 추정된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.460-465
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• 1996

한국재래간장으로 부터 분리한 Bacillus subtilis globigii CCKS-118가 생성하는 pretense 생산 최적조건은 2% soluble starch, 0.2% yeast extract, 0.1% $(NH_4)_2SO_4$, 0.2% $MgSO_4$, pH 7.5, $35^{\circ}C$에서 20시간이었다. 효소의 최적작용 pH와 온도는 pH 9.0, $50^{\circ}C$였으며, $pH\;6.0{\sim}11.0$의 범위와 $40^{\circ}C$이하에서 안정하였다. 금속이온중 $Cu^{2+}$에 의하여 활성이 증대되었으나 $Hg^{2+}$ 등에 의하여 효소활성이 저해되었다. Phenylmethylsuldonyl fluoride, ethylendiaminetetraacetic acid처리에 의해 활성이 저해되어 금속이온의 영향을 받는 serine pretense로 확인되었다. Km값은 $1.899{\times}10^{-4}M$, $V_{max}$값은 $34.36\;{\mu}g/min$이었으며, hemoglobin보다 casein을 더 잘 가수분해하였다.

• 미생물학회지
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• 제45권4호
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• pp.291-299
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• 2009

본 연구에서는 Human HtrA3 (HtrA3)의 효소활성을 분자수준에서 연구하기 위해 HtrA간의 상동성과 기존에 알려진 maturation site들을 비교 분석하여 예상 mature HtrA3인 M1-HtrA3와 M2-HtrA3를 발현하는 construct를 제작하였다. pGEX system을 통해 Top10 균주에서 발현, 정제한 M1-HtrA3 단백질은 $10{\mu}g$/L를 정제할 수 있었으며 발현량 대비 1%를 회수할 수 있었다. M2-HtrA3는 M1보다 5배 가량 많은 양을 정제할 수 있었으며 발현량 대비 회수율은 3배 정도 더 높았다. $\beta$-Casein을 이용한 in vitro cleavage test를 통해 M1, M2 form 모두 protease 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한, $\beta$-casein cleavage를 통해 HtrA serein protease들 간의 상대적인 활성을 비교한 결과, HtrA3와 HtrA2는 HtrA1보다 약 2배 더 높은 proteolytic cleavage 활성을 보였다. 본 연구에서 정립한 protease 활성을 지닌 HtrA3의 제작과 정제 조건은 HtrA3의 substrate를 탐색을 용이하게 할 수 있을 것이며, HtrA3 연관된 질환의 발병기전과 세포 신호전달을 이해하는 연구에 활용될 수 있을 것이다.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1996년도 춘계학술대회
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• pp.165-165
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• 1996

균의 감염에 의해 유도되는 패혈성 shock는 균이 분비하는 elastase가 관여하며, 외부에서 serine pretense inhibitor의 biopolymer의 투여로 균에 의해 유도된 패혈성 shock를 억제시킬 수 있다고 보고되고 있다. 이에 본 연구진은 패혈성 치료제의 개발의 목적으로, 국내에서 민간 약으로 많이 이용되고 있는 백편두로부터 새로운 elastase inhibitor를 분리, 정제하여 부분 아미노산 서열 및 특성을 조사하였기에 발표하고자 한다. 백편두 추출액을 여러 차례에 걸쳐 column chromatography을 수행하면서 얻어지는 각 fraction에 대하여 elastase MCA-기질 및 trypsin MCA-기질을 이용하여 활성 측정 후 elastase 기질 및 trypsin 기질에 대하여 활성을 억제하는 fraction들을 모아 $C_{18}$ open column chromatography 및 $C_{18}$ HPLC 과정을 수행하여 2종류의 trypsin 활성 억제 물질과 1종류의 elastase inhibitor를 분리, 정제하여 각각을 Ti1, Ti2 및 Ti3로 명명하였다. 전기영 동 상에서 단일 hand를 확인한 후 각각의 inhibitor들의 부분 아미노산 서열을 결정하였다.

• KSBB Journal
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• 제8권4호
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• pp.405-408
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• 1993

Absidia zychae NRIC 1199 produced two forms of carboxypeptidase(CPZ-1 and CPZ-2) which were distinguished in their isoelectric points but had almost identical properties(1). The amino acid sequences for the N-terminal of both enzymes were the same (Tyr-Thr-Ser-Pro-Lys-Leu-Xaa-Asp-Pro-Asp-Val) and any significant difference was not observed between amino acid compositions of the two enzymes. The ouchterlony double diffusion technique using antibody raised against the CPZ-2 protein demonstrated a good cross-reaction between CPZ-1 and CPZ-2 Genomic Southern analysis showed only one gene encoding CPZ in the genome of Absidia zychae. However, a significant difference between two enzymes was observed on peptide map using Staphylococcus aureus V8 protease, distinguishable only one band, indicating that multiple forms of CPZ are caused by post-translational modification, such as deamidation.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제6권1호
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• pp.1-6
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• 1996

A bacterial strain NS70 producing an alkaline protease was isolated from soil samples taken near a hot spring and identified as Bacillus licheniformis by its morphological and physiological properties and cellular fatty acid analysis. The isolated alkaline protease was purified by ammonium sulfate fractionation, DEAE-, CM-, and Phenyl-Sepharose column chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 32, 000 Da by sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Its optimal pH and temperature for proteolytic activity against Hammarsten casein were 12 and $65^{\circ}C$, respectively. The enzyme was stable at alkaline pH range from 6.0 to 12.0, and fairly stable up to $65^{\circ}C$. The enzyme was inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride but not by EDTA and N-ethylmaleimide indicating that the enzyme is serine protease. Enzyme activity was markedly inhibited by $Hg^{2+}$ and $Cu^{2+}$. Autolytic phenomena were observed on purified protease NS70 but autolysis was reduced by the addtion of $Ca^{2+}$ ion or bovine serum albumin.

• Journal of Microbiology
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• 제41권4호
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• pp.289-294
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• 2003

Gelatinase is a proteolytic enzyme that hydrolyzes gelatin. Gelatinolytic activity was detected from culture broths of Streptomyces griseus IFO13350 and HH1 by paper disc assays on 0.5% agar plates containing 1% gelatin. The concentrated extracellular protein from the S. griseus was analyzed by SDS polyacrylamide gel, and two proteins, with molecular weights of 30 and 28 kDa, respectively, were identified to have gelatinase activity by gelatin zymography. The protein with a molecular weight of 28 kDa was confirmed to be S. griseus trypsin (SGT). The effects of metal ions and metal chelators on the protease activity of the SGT were studied. Of the metal ions tested, only manganese was found to enhance the protease activity, 2.6 times, however, $Co^{2+},\;Cu^{2+},\;and\;Zn^{2+}$, and metal chelators, such as EDTA and EGTA, inhibited the SGT activity. When the protease activity of the SGT was measured at various pHs, in the presence of 5 mM $MnCl_2$, its highest activity was at pH 11.0, whereas only 60% of the maximum activity was observed between pHs 4.0 and pH 6.0, and almost 80% activity between pHs 7.0 to pH 10.0. The protease activity was measured at various temperatures in the presence of 5 mM $MnCl_2$. The SGT was found to be stable up to $60^{\circ}C$ for 30 min, while only 16% of the enzyme activity remained at $60^{\circ}C$, and at $80^{\circ}C$ almost all the activity was lost. The optimal temperature for the protease activity was $50^{\circ}C$.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제34권2호
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• pp.436-456
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• 2024

Several thermostable proteases have been identified, yet only a handful have undergone the processes of cloning, comprehensive characterization, and full exploitation in various industrial applications. Our primary aim in this study was to clone a thermostable alkaline protease from a thermophilic bacterium and assess its potential for use in various industries. The research involved the amplification of the SpSKF4 protease gene, a thermostable alkaline serine protease obtained from the Geobacillus thermoglucosidasius SKF4 bacterium through polymerase chain reaction (PCR). The purified recombinant SpSKF4 protease was characterized, followed by evaluation of its possible industrial applications. The analysis of the gene sequence revealed an open reading frame (ORF) consisting of 1,206 bp, coding for a protein containing 401 amino acids. The cloned gene was expressed in Escherichia coli. The molecular weight of the enzyme was measured at 28 kDa using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The partially purified enzyme has its highest activity at a pH of 10 and a temperature of 80℃. In addition, the enzyme showed a half-life of 15 h at 80℃, and there was a 60% increase in its activity at 10 mM Ca²⁺ concentration. The activity of the protease was completely inhibited (100%) by phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF); however, the addition of sodium dodecyl sulfate (SDS) resulted in a 20% increase in activity. The enzyme was also stable in various organic solvents and in certain commercial detergents. Furthermore, the enzyme exhibited strong potential for industrial use, particularly as a detergent additive and for facilitating the recovery of silver from X-ray film.

• 생명과학회지
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• 제23권12호
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• pp.1486-1494
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• 2013

Octopus vulgaris의 장관으로부터 단백질 가수분해력과 활성을 측정함으로서 높은 단백질분해효소 생성능을 가진 균을 분리하여 동정하였다. 균이 생성한 단백질분해효소는 황산암모늄침전, cellulose CM-52 양이온 교환 크로마토그래피, DEAE-Sephadex A50 음이온 교환 크로마토그래피의 3단계를 통해 정제하였다. 장관으로부터 분리한 균중 가장 높은 단백질분해효소 생성능을 가진 균은 Bacillus sp. QDV-3로 나타났으며 이균을 분리한 후 표현형 분석, 생화학적 특성, 16S rRNA 유전자염기서열분석을 통해 Bacteria역, Firmicutes문, Bacilli강, Bacillales목, Bacillaceae과, Bacillus속으로 Bacillus flexus와 99.2%의 유사성을 보이는 것으로 확인하였다. 균이 생성한 단백질 분해효소를 QDV-E로 지정하였으며 61.6 kDa의 분자량을 나타내었다. 이 효소는 pH 9.0~9.5에서 활성을 나타내었고 최적온도는 $40^{\circ}C$였으며 $50^{\circ}C$에서는 60분간 96% 이상의 활성을 보유하였다. Phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF)에 의하여 활성이 억제 되었으므로 세린 알칼리성 단백 분해 효소인 것으로 결론지었다. 금속이온인 $Mn^{2+}$ 와 $Mg^{2+}$에 의하여 효소활성 상승효과를 보였으며 $Ba^{2+}$, $Zn^{2+}$, 그리고 $Cu^{2+}$에 의하여 활성이 억제되었다.

• 분석과학
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• 제24권2호
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• pp.78-84
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• 2011

본 연구에서는 양성 및/또는 음성 이온 방식으로 저에너지 충돌-유발 분해(CID)를 이용한 serine protease 저해제인 camostat 와 그것의 분해산물인 4-(4-guanidinobenzoyloxy)phenylacetic acid (GBPA)의 분해 패턴을 전자분무 소스가 있는 사중극자 텐덤 질량분석기(ESI-MS/MS)를 이용하여 최초로 조사하였다. Camostat의 양이온 CID 질량 스펙트럼 분석결과, 분자구조내 에스테르 결합을 이루는 카르보닐 기와 산소 원자사이의 단일 결합(C-O) 분해가 우선적으로 일어나고, guanidine 기의 초기 손실보다는 N,Ndimethylcarbamoylmethyl기의 초기 손실이 더 잘 일어난다는 것이 특징적으로 확인되었다. GBPA의 양이온 CID 스펙트럼의 경우는, 4-guanidinobenzoyloxy 기에 있는 카르보닐 기와 산소원자 사이의 초기 분해가 일어나서 m/z 145에서 가장 강도가 높은 피크를 만들었다. 반면에, GBPA의 음이온 스펙트럼은 m/z 312의 모분자 이온에서 $CO_2$와 NH=C=NH의 순차적인 중성 손실로 인하여 m/z 226의 가장 강도가 높은 피크가 특징적으로 생성되었다.