• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
• /
• pp.48-48
• /
• 2003

본 실험은 spermatogonia 단계에 발현하는 유전자를 찾기 위하여 suppression subtractive hybridization를 수행하였다. 기존에 mouse에서는 spermatogonia 특이적인 유전자들이 밝혀져 있기 때문에 pig에 특이적인 유전자를 찾기 위하여 pig 250days testis와 pig 60days testis를 재료로 하여 실험하였다. SSH를 통하여 254days testis에 특이적으로 발현되는 후보유전자를 7개 찾았고 25days testis와 60days testis 의 Northern blot을 통하여 25days에 과발현하고 60days에 발현의 양이 대폭 줄어드는 spermatogonia 유전자로 생각되는 후보유전자 2개를 선택하여 pig tissue northern blot, genomic DNA southern blot, RT-PCR 그리고 In-situ hybridization을 수행하였다. Tissue northern blot과 RT-PCR을 통하여 후보자 1번은 간과 폐, 난소, 정소에서 발현하고, 후보유전자 15번은 난소와 정소에서만 특이적으로 발현함을 알았다. DNA sequence analysis와 NCBI Blast search를 통하여 후보자 1번은 다른 종에서 밝혀진 유전자였고 후보유전자 15번은 어느 종에서도 밝혀지지 않은 새로운 유전자였다. Degenerated primer를 통하여 후보자 1번의 pig full sequence를 밝히고 NCBI에 등록하였다. 그리고 In-situ hybridization을 통하여 후보유전자득이 20일째 testis의 Leydic cell에서 많이 발현되고 adult testis에서는 발현이 감소하는 결과를 얻었다. 이것으로 보아 위의 두 후보유전자는 spermatogonia에 직접 관련된 유전자이기 보다는 spermatogonia의 발달에 영향을 주는 leydic cell 특이발현을 가진 유전자로 사료되어진다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
• /
• 대한불임학회 2001년도 제2차 연수강좌
• /
• pp.195-205
• /
• 2001

태반 영양배엽 (trophoblast)은 포유동물의 발생과정 중 가장 먼저 분화되는 세포로서, 자궁환경내에서 배아가 착상, 발생, 및 분화하기 위해서 반드시 필요한 태반을 형성하는 색심적인 세포이다. 영양배엽 세포의 분화과정중의 결함은 배아의 사산이나 임신질환 등의 치명적 결과를 초래한다. 하지만, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 분자생물학적인 메카니즘은 아직 규명되지 않고 있다. 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 경로를 규경하기 위한 선결과제는 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 많은 유전자들이 밝혀져야만 한다. 본 연구팀은 최근에 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 두 종류의 새로운 유전자들을 찾았다. 한 종류는 homeobox를 보유하고 있는 조절 유전자 Psx이고, 다른 한 종류는 임신호르몬인 태반 프로락틴 라이크 단백질 유전자 PLP-C${\beta}$이다. 본 연구과제의 목표는 이들 유전자의 기능과 조절 메카니즘을 규명함으로써, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 조절경로를 밝히는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 일련의 연구를 수행할 것이다. 1) Psx 유전자가 분화된 영양배엽 세포에서만 발현케 하는 조절 메카니즘을 규명하기 위해 functional assays, in vitro footprinting, gel mobility shift assays, 생쥐형질전화, UV crosslinking, Southwestern blot 등의 방법을 통해 Psx 유전자의 cis-acting 요인과 trans-acting factor를 밝혀 분석한다. 2) 영양배엽 세포의 분화조절 경로를 규명하기 위해 random oligonuclotide library screening, DD-PCR, subtractive screening 등의 방법을 이용하여 Psx 유전자에 의해 조절되는 하부유전자를 밝힌다. 3) Psx 유전자를 knock-out시켜 영양배엽 세포가 발달 및 분화하는데 미치는 역할을 밝힌다. 4) Yeast two-hybrid screening방법을 이용하여 태반 프로락틴 유전자의 수용체를 찾아 이들의 신호전달 기전을 밝힌다. 제1차년 연구결과로서, mouse와 rat으로부터 각각 Psx 유전자의 genomic DNA를 클로닝하여, 유전자 구조를 비교한 결과, mouse Psx (mPsx2)는 4개의 exons으로 이루어져 있는 반면에, rat Psx (Psx3)는 3개의 exons으로 구성되어 있었다. 즉, rPsx3는 mPsx2의 exon1이 없었다. Notrhern blot과 in situ hybridization 분석에 의해 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 발현 조절되는 현상을 밝혔다. 실제로 mPsx2와 rPsx3의 5'-flanking지역을 클로닝하여 염기서열 분석 결과 전혀 homology를 찾을 수 없었다. 또한, 이들 각각 promoter의 activity를 luciferase reporter를 이용하여 조사한 결과 Rcho-1 trophoblast cells에서 각기 다른 activity를 보여 주는 것을 발견하였다. Psx 유전자의 transcription start sites는 Primer extension에 의해 밝혔다. 또한 Psx2 유전자를 knock-out 시키기 위해 targeting vector를 Osdupde1에 제작하였다. 본 과제를 시작할 때 새로운 프로락틴 유전자 하나를 클로닝하여 이 유전자를 PLP-I라고 이름을 붙였다. 이 후 이 유전자 (PLP-I)는 PLP-C${\beta}$라고 이름을 붙이게 되었다. Mouse PLP-C${\beta}$ 유전자의 counterpart를 rat에서 찾아 염기서열을 비교한 결과 mouse와 rat에서 PLP-C${\beta}$유전자의 homology는 약 79% (amino acid level)였다. 본 연구과정을 통해 또 하나의 새로운 PLP-C subfamily member를 mouse로부터 클로닝 하였고, 이 유전자를 PLP-C${\gamma}$라 하였다. PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$의 발현 유형은 Northern blot과 in 냐셔 hybridization 분석에 의해 태반의 제한된 spongitrophoblast와 trophoblast giant cells에서만 발현하는 것을 밝혔다. 놀랍게도 이들 두 새로운 유전자는 alternative splicing에 의해 두 종류의 isoform이 있음을 밝혔다. PLP family member 유전자로서 splicing에 의한 isoforms을 보여 주는 유전자로는 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 최초이다. 이들 isoform mRNAs의 발현 유형은 RT-PCR 방법을 이용하여 규명하였다. 또 하나의 새로운 발견은 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 독특한 유전자 구조를 갖고 있었다. 즉, PLP-C${\beta}$는 exon3의 alternative splicing에 의해 5개 혹은 6개의 exons을 갖는 two isoforms이 생긴다. 반면에 PLP-C${\gamma}$는 exon2가 alternative splcing이 되면서 7개의 exons을 갖거나 6개의 exons을 갖는 isoforms을 만든다. 그리고, PLP-C${\gamma}$의 promoter activity를 trophoblast Rcho-l${\gamma}$ 세포주를 이용하여 PLP-C${\gamma}$ 의 1.5 kb 5'-flanking 지역이 trophoblast-specific promoter activity를 갖고 있음을 밝혔다. PLP-C${\gamma}$ 유전자의 transcription start site는 Primer extension에 의해 밝혔다. 제 1차 년도의 연구결과를 토대로, 2차년에서는 다음단계의 연구를 수행하고자 한다. 즉, 1) mPsx2와 rPsx3의 promoter를 비교분석 함으로서 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 조절되는 메카니즘 규명, 2) Psx와 PLP-C 유전자의 promoter에 있는 cis-acting elements 탐색, 3) Psx2와 Psx3의 단백질을 이용하여 이들이 binding하는 target sequence 규명, 4) 제작한 Psx2 targeting vector를 이용하여 ES cells에서 Psx2 유전자 knock-out, 5) Psx 유전자를 과발현시키는 세포주를 만들고 Psx에 의해 조절되는 유전자 탐색, 6) 새로 밝히 PLP-C members 유전자들의 조절기전을 Rcho-1 세포주를 이용하여 여러 거지 성장인자와 다른 호르몬에 대한 반응을 탐색, 7) Psx와 PLP-C${\gamma}$ 유전자의 chromosomal mapping 등을 밝힐 것이다.

• Journal of Plant Biology
• /
• 제35권3호
• /
• pp.237-245
• /
• 1992

감자 (Solanum tuberosum L. cv. Superior)에서 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter의 발현 양상 및 외래 유전자의 발현에 미치는 intron fragment의 효과를 조사하기 위하여 옥수수의 alcohol dehydrogenase 1-S (Adh1-S) intron 1의 249 base pairs 와 ${\beta}-glucuronidase$ (GUS) 유전자를 결합한, CaMV 35S/deleted Adh1 intron-GUS 구조의 유전자 전달벡터를 제조하고 이를 Agrobacterium tumefaciens를 매개로 형질전환을 유도하였다. 유전자 전달벡터인 pLS201는 17.7 kilobase pairs로서 형질전환의 초기 선별에 용이한 kanamycin 저항성 유전자와 GUS 유전자를 갖는 구조로 제조되었다. 형질전환된 개체의 조직화학적 분석 결과 CaMV 35S promoter에 의한 GUS 유전자는 모든 기관에서 발현되었고, 줄기 및 뿌리에서는 세포분열이 활발한 유관속 형성층을 중심으로 강한 발현을 나타내었다. GUS 유전자의 발현에 미치는 intron fragment의 효과를 조사하기 위하여 CaMV 35S/GUS 구조의 plasmid (pBI121)를 형질전환된 개체를 대조구하여 GUS 활성을 조사한 결과 pLS201의 잎, 줄기, 뿌리에서 각각 30, 34, 42배 높은 활성을 보여, 옥수수 탈수소 효소 유전자의 절단된 인트론이 GUS 유전자의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.

• 미생물학회지
• /
• 제33권4호
• /
• pp.232-236
• /
• 1997

Septin 유전자는 Saccharomyces cerevisiae에서 filament를 암호화하고 있으며 세포질분열이나 bud의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다. S. cerevisiae에서 septin유전자는 4가지가 발견되었으며 초파리나 쥐의 세포에서도 발견되고 있다. 본 연구에서는 PCR 방법을 이용하여 Schizosaccharomyces pombe에서 septin 유전자를 찾아내었다. S. pombe의 septin 유전자는 1143 bp의 open reading frame을 갖고 있으며 380개의 아미노산으로된 42 kd의 분자량을 가진 단백질을 암호화하였다. S. cerevisiae의 septin 유전자의 하나인 $CDC_{12}$ 유전자와의 유사성을 비교한 결과 51.8%의 유사성이 있음이 밝혀졌다.

• 생명과학회지
• /
• 제19권11호
• /
• pp.1666-1671
• /
• 2009

배추과에 있어서 SLG (S locus glycoprotein)와 SRK (S locus receptor kinase) 유전자는 자가불화합성의 인식반응에 관여한다. 또한 수화작용에 중요한 aquaporin (MOD) 유전자 역시 자가불화합성 작용에 요구된다. 본 실험은 양배추 자가화 합성(SC) 계통으로부터 SC-SLG, SC-SRK, 및 SC-MOD 유전자들을 동정하고 이들 유전자의 물리적 구조를 분석하였다. 그 결과 이들 유전자들은 기존에 보고된 유전자들과 높은 상동성을 보였고 RT-PCR에 의한 발현 해석에 있어서 정상적인 발현을 나타내었다. 이들 결과들로 부터, 자가화합 양배추 계통은 주두측 자가불화합성 유전자에 이상이 있는 것이 아니라 화분측 자가불화합성 유전자의 이상 그리고/또는 S-locus에 연쇄 되어 있지 않지만 자가불화합성에 관여하는 유전자의 변이에 의해 자가불화합성이 타파되었다고 생각된다.

• 생태와환경
• /
• 제38권4호통권114호
• /
• pp.510-517
• /
• 2005

선형의 남조류 아나베나는 광합성과 질소고정 능이 있으며, 이는 아마도 이 남조류가 각종 육수 환경에 잘 적응하는데 큰 역할을 했다고 볼 수 있다. 작은 patS라는 유전자는 질소 고정세포의 형성을 막으며 결과적으로 질소원이 부족한 환경에서 아나베나의 죽음을 가져온다. 본 연구는 patS 유전자 주변의 DNA 염기 서열을 분석하여 codon 활용도를 알아 본 결과 patS를 제외한 다른 유전자가 존재하지 않음을 밝혔다. patS를 포함하는 세 개의 겹치는 cosmid를 찾아서 기존의 알려진 이형세포 발달 유전자를 탐색하였으나 나타나지 않았다. 질소원의 결핍에 반응하는 patS 유전자의 발현을 Northern blot 분석과 lacZ reporter 유전자 합성 실험을 통하여 각각 전사와 번역의 단계에서 알아보았다. patS 유전자의 발현은 배지로부터 질소원이 제거된 후 12시간 내에 급격히 증가하는 것으로 나타났다.

• 미생물학회지
• /
• 제45권4호
• /
• pp.430-434
• /
• 2009

세균 16S rRNA 유전자 염기서열은 분자계통분류, 진화역사 규명, 미생물 검출 등 다양한 목적으로 이용되어 왔다. 세균 제놈(genome)은 multiple rRNA 오페론을 갖고 있으며, 이들 유전자 염기서열은 일부 변이가 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 Vibrio 속의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 세포 내 16S rRNA의 이질성을 규명하였다. 분석은 GenBank 자료 중에서 제놈 염기서열 annotation이 완료된 V. cholerae, V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. splendidus, V. vulnificus를 이용하여 실시하였다. Vibrio 속은 1번 염색체에 7~10개의 16S rRNA 유전자 copy를 갖고 있으며, 이들의 세포 내 유전자 변이는 0.9% 이하 상이성(99.1%이상 DNA 상동성)을 보였다. 2번 염색체에서는 16S rRNA 유전자가 1개 이하로 존재하였다. 유전체내 16S rRNA 유전형은 최소 5개(V. vulnificus #CMCP6)에서 최대 8개(V. parahaemolyticus #RIMD 2210633, V. harveyi #ATCC BAA-1116)로 조사되었다. 본 결과는 Vibrio 속의 16S rRNA 유전자 염기서열이 높은 이질성을 갖는 것을 제시해 준다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
• /
• pp.49-49
• /
• 2003

본 연구에서는 vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G)를 envelope로 가지는 pantropic retrovirus vector system을 이용하여 재조합 human FSH 유전자가 전이된 형질전환 닭을 생산하고자 하였다. Human FSH $\alpha$ 및 $\beta$ 유전자와 CTP linker는 human pituitary gland cDNA library에서 RT-PCR 방법을 이용하여 cloning하였으며, 각각의 fragment는 FSH$\beta$-CTP-FSH$\alpha$ 순서의 단일사슬로 연결하였다. 연결된 FSH$\beta$-CTP-FSH$\alpha$는 retroviral vector 내의 $\beta$-actin promoter의 조절 하에 도입한 후, PT67 packaging cell line에 transfection하여 virus를 생산하였으며 생산된 virus는 pantropic한 virus producing cell인 GP293에 infection하여 FSH 유전자가 도입된 virus를 생산하였다. FSH 유전자의 발현을 in vitro에서 확인하기 위하여 CHO (chinese hamster ovary) 세포에 virus를 감염시킨 후, 세포의 배양액을 취하여 electrochemilumine-scence immunoassay 방법으로 정량하였다. In vitro에서 전이 후 발현이 확인된 FSH 외래유전자의 retroviral vector virus를 초원심분리로 고농축하여 stageX의 계란의 배반엽 층에 주입하였으며, 그 결과 18%의 부화율과 91%의 부화한 닭의 유전자 전이율을 확인할 수 있었다. 전이된 유전자의 확인은 FSH$\beta$와 Neo 유전자에 대한 primer를 이용한 RT-PCR의 방법을 이용하였다. In vitro에서와는 달리 in vivo에서는 FSH 유전자의 전이는 확인되었으나 발현을 확인하지는 못하였는데, 이는 적은 수의 실험군이 형질전환율에 비해 상대적이지 못하였거나, 외래 유전자인 FSH의 발현에 의한 생리적인 부작용이 유발되어 해당개체가 부화되지 못한 것으로 추정된다. 본 문제점을 해결하기 위하여 실험군의 수를 늘리고 외래 유전자에 대한 controllable expression system이 보완될 필요성이 요구되며, 이러한 점이 해결된다면 높은 유전자 전이율에 기인하여 retrovirus를 이용한 형질전환 방법은 형질전환 가금의 생산에 있어서 매우 효율적이고 주목할 만한 방법으로 사료된다.

• 한국미생물생명공학회:학술대회논문집
• /
• 한국미생물생명공학회 2000년도 Proceedings of 2000 KSAM International Symposium and Spring Meeting
• /
• pp.193-198
• /
• 2000

PCBs를 분해하는 bphABC유전자를 plasmid vactor pMFB2에 유전자조작한 Pseudomonas putida AC30(pMFB2)를 PCBs에 오염된 연안해역의 해수와 저니로 만든 microcosm에 도입한 결과, 각각 도입 4일과 7일만에 사멸하였다. 그러나, 도입한 P. putida AC30(pMFB2)는 사멸하였지만, 연안해수와 저니 microcosm에서 plasmid pMFB2가 전이한 토착미생물이 검출되었다. 도입한 P. putida AC30(pMFB2)의 생잔실패의 원인을 분석한 결과 공경 0.2$\mu\textrm{m}$의 filter를 통과하는 물질과 생물이 가장 크게 영향을 미치는 것으로 나타났다. 유전자조작 P. putida AC30(pMFB2)의 도입과 bphABC유전자의 토착미생물로의 전이에 따른 토착미생물군집에 미치는 영향을 개체수 변동으로 조사한 결과, 토착미생물 군집에 미치는 영향은 보이지 않았다. P. putida AC30(pMFB2)의 도입에 의한 PCBs의 생분해성을 분석하였다. 그러나, 도입한 유전자조작 균주가 생잔에 실패함으로써 잔류하고 있는 PCBs의 농도변화는 보이지 않았다.

• 미생물과산업
• /
• 제17권1호
• /
• pp.19-24
• /
• 1991

tRNA는 그 생화학적인 역할이 잘 알려져 있고 구조적으로 안정하며, 이용할 수 있는 분자 생물학적인 자료가 많아, 유전자 발현과 유전자 산물간의 조직적인 상호작용을 연구하는데 적합한 재료이다. 효모의 미토콘드리아에는 24개의 tRNA 유전자가 잇어, 단백질 합성에 필요한 tRNA를 자급하고 있으나, 유전자 발현과 processing에 관여하는 모든 정보가, tRNA의 5' 부위를 process하는데 관여하는 효소중 RNA subunit인 9S RNA를 산출하는 tsl 유전자를 제외하고, 핵 유전자에 존재한다. 효모의 대표적인 종인 Saccharomyces cerevisiae의 $tRNA^{Asp}$ 유전자에 결함이 생긴 한 돌연변이 균주의 성질을 조사하고, 억제현상(suppression)을 규명하므로써 tRNA의 구조적 특성을 파악하고, 나아가 미토콘드리아 생성에 관여하는 핵 유전자를 찾아보고자 한다.