• 제목/요약/키워드: Pseudomonas sp. HK-6

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폭약 Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine(RDX)에 노출된 분해세균 Pseudomonas sp. HK-6의 세포반응과 형태변화 (Cellular Responses and Morphological Changes of RDX-degrading Bacterium, Pseudomonas sp. HK-6 Exposed by Explosive Hexahydro-1,3,5-triaitro-1,3,5-triazine (RDX).)

  • 장효원;강형일;김치경;오계헌
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제31권1호
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    • pp.75-82
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    • 2003
  • 환경 오염원으로서 폭약 hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine(RDX)에 대한 RDX 분해세균 Pseudomonas sp. HK-6의 세포반응과 형태변화에 대하여 조사하였다. 아치사조건의 RDX농도와 노출시간에 따른 균주 HK-6의 생존율을 분석한 결과, 이 세균의 생존율은 스트레스 충격 단백질의 생성과 비례하였다. 총세포 지방산 조성분석에서 균주 HK-6는 trypticase soy agar(TSA)에서 자랄 때 보다 RDX배지에서 자랄 때 여러 가지 종류의 지방산이 생성되거나 사라지는 것이 밝혀졌다. Anti-DnaK와 anti-GroEL을 이용하여 SDS-PAGE와 Western blot을 통한 분석으로 균주 HK-6는 70 kDa DanK와 60 kDa GroEL을 포함하는 몇가지 스트레스 충격단백질을 생성하는 것으로 밝혀졌다. RDX에 노출된 HK-6배양에서 수용성 단백질 분획에 대하여 2-D PAGE를 실시하였으며, pH 3에서 pH 10 범위에서 약 300 spots가 silver로 염색된 gel상에서 관찰되었다. 그 결과, RDX에 대한 반응으로 10여개의 spots가 현저히 유도 발현되었다. RDX(0.135mM, 12시간)에 노출된 세포는 구멍이 나타나고 표면의 불규칙적인 형태 변화가 일어나 죽게되는 것이 주사 전자현미경을 통하여 관찰되었다.

폭약 TNT를 분해하는 세균인 Pseudomonas SP. HK-6에서 분리정제된 Nitroreductase의 특성연구 (Characterization of Nitroreductase Purified from TNT-degrading Bacterium, Pseudomonas sp. HK-6.)

  • 호은미;강형일;오계헌
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제32권3호
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    • pp.230-237
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    • 2004
  • 균주 Pseudomonas sp. HK-6로부터 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)의 대사 과정에서 유도되는 nitroreductase (NTR)를 분리 및 정제하여 다양한 특성조사를 실시하였다. NTR은 균주 HK-6의 세포추출물로부터 ammonium sulfate 침전, DEAE-sepharose, 그리고 Q-sepharose chromatography의 일련의 과정을 통하여 분리되었고, NTR의 활성을 가지는 세개의 다른 fractions를 확인하였다. 균주 HK-6의 NTR fractions I, II, 그리고 III의 비 활성은 각각 4.85 unit/mg, 5.47 unit/mg, 5.01 unit/mg으로 측정되었으며, 세포추출물에 비해 각각 9.0배, 10.1배, 9.3배 농축된 것으로 나타났다. SDS-PAGE에서 측정된 균주 HK-6의 NTR fractions I, II 그리고 III의 분자량은 모두 약 27 kDa으로 확인되었다. 정제된 NTR의 활성에 온도, pH, 금속 이온, 억제 물질의 효과와 기질 특이성 등에 대한 물리화학적 특성 조사를 실시하였다. 균주 HK-6의 NTR fractions I, II, 그리고 III의 적정온도는 $25~35^{\circ}C$ 확인되었고, 모두 $30^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, 이들 효소 활성의 적정 pH는 7.0~8.0이었고, 최적 pH는 7.5로 확인되었다. TNT에 대한 HK-6의 NTR fractions I, II, 그리고 III의 활성은 금속 이온 $Ag^{+}$ , $Cu^{2+}$ , 그리고 $Hg^{V}$ 에 의해서 약 70%이상 저해되었으며, $Mn^{2+}$ 또는 $Ca^{2+}$ 에 의해서 약 20~50%로 활성이 억제되었다. 그러나 $Fe^{2+}$ /첨가 시에는 효소의 활성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. NTR의 활성에 대한 억제물질의 영향은 $\beta$-mercaptoethanol 첨가 시에 효소의 활성이 모두 억제되었고, dithiothreitol, EDTA, 그리고 NaCl 첨가시에도 활성이 감소하는 것으로 확인되었다. TNT와 그 유사기질을 이용하여 HK-6에서 분리된 NTR의 기질 특이성을 조사한 결과, TNT, nitrobenzene, 그리고 RDX에 대해서는 비교적 활성이 높게 나타났으나 2,6-DNT와 2,4-DNT에서는 낮은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

TNT에 대한 세균의 반응기작: 생존율, 스트레스 유도단백질의 SDS-PAGE 및 2-D 전기영동 분석 (Responses of Bacteria to TNT: Cells′Survival, SDS-PAGE and 2-D Electrophoretic Analyses of Stress-Induced Proteins)

  • 오계헌;장효원;강형일;김승일
    • 미생물학회지
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    • 제38권2호
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    • pp.67-73
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    • 2002
  • 폭약 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)스트레스 조건하에서 토양세균 Pseudomonas sp. HK-6의 세포반응에 대하여 조사하였다. 다양한 농도의 TNT에 노출됨으로서 약 70-kDa DnaK와 60-kDa GroEL의 스트레스 충격단백질 (stress shock proteins, SSPs)이 단떠질이 유도되었다. 이들 SSPs의 존재는 SDS-PAGE과 anti-DnaK와 anti-GroEL monoclonal antibodies를 이용한 Western bolt을 통하여 확인되었다. SSPs은 0.5 mM TNT로 6-12 시간 처리된 세포에서 나타났으며, TNT에 노출 후8시간대 에서 최대의 단백질 유도가 관찰되었다. $30^{\circ}C$에서 $42^{\circ}C$로 열변환충격을 주었을 때의 SSPs는 TNT노출에서와 유사한 유도양상을 보여주었다. TNT에 노출된 Pseudomonas sp. HK-6세포에서 유도된 SSPs의 존재는 배양된 세포의 수용성 단백질 분획에 대하여 2-D PAGE를 통하여 확인되었다. Coomassie brilliant blue R25O로 염색된 젤로부터 pH 3-10 범위에서 약 450 개의 spots이 탐침되었으며, 이들 가운데 12 개의 spots이 TNT 스트레스에 대하여 현저하게 유도되었다. Gel상에서 가장 짙게 나타난 대표적 인 spot에 대한 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과, $^1XXAKDVKFGDSARKKML^17$로서, Pseudomonas putida의 GroEL의 N-말단 아미노산 염기서열인 $^1XXAKDVKFGDSARKKML^17$과 동일한 것으로 분석되었다.

Pseudomonas sp. HK-6의 xenA 돌연변이체를 이용하여 RDX 폭약에 노출된 세포반응들의 통합적 분석 (Integrative analysis of cellular responses of Pseudomonas sp. HK-6 to explosive RDX using its xenA knockout mutant)

  • 이병욱;최문섭;석지원;오계헌
    • 미생물학회지
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    • 제54권4호
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    • pp.343-353
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    • 2018
  • 이전 연구에서 우리는 RDX (hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine) 분해세균 Pseudomonas sp. HK-6에서 xenobiotic reductase B를 암호화하는 xenB 유전자의 돌연변이 균주를 이용하여 RDX 스트레스에 대한 xenB 유전자의 역할에 관하여 연구를 보고하였다[Lee et al. (2015) Curr. Microbiol. 70(1): 119-127]. 본 연구에서는 Pseudomonas sp. HK-6 xenA 돌연변이 균주로 연구 범위를 확대하여 RDX 스트레스 조건에서 세포반응과 프로테옴 프로필의 변화를 분석하였다. RDX 첨가 배지에서 xenA 돌연변이 균주는 야생균주와 비교하여 RDX를 약 2배 정도 느리게 분해하였으며, RDX 스트레스 하에서 xenA 돌연변이 균주의 생장률과 생존율은 야생균주와 비교하여 낮았다. RDX 스트레스에 의한 심한 형태적 손상이 xenA 돌연변이 균주의 세포 표면에 발생하는 것이 주사전자현미경을 통해서 확인되었다. RDX 스트레스 하에서 야생균주에서 발현된 충격단백질인 DnaK 및 GroEL의 양은 배양 초기 혹은 상대적으로 낮은 RDX 농도에서는 증가하였으나, 배양시간이 길어지거나 높은 RDX 농도에서는 다소 감소하였다. 그러나 xenA 돌연변이 균주에서는 DnaK와 GroEL의 발현양은 RDX 농도가 증가함에 따라 점차 감소되었다. RT-qPCR에 의해 측정된 야생균주에서 dnaA와 groEL의 전사 수준은 RDX 스트레스가 증가된 상태에서 잘 유지되었으나, xenA 돌연변이 균주에서는 점차 감소되어 결국에는 소멸되었다. RDX 스트레스에서 xenA의 돌연변이에 의한 프로테옴 프로필의 변화를 2-DE PAGE를 통해서 관찰한 결과에 따르면 27개 단백질이 감소하고 3개가 증가한 것으로 나타났다. 이들 결과로 보아, 정상적인 xenA 유전자는 RDX 스트레스 하에서 세포의 온전한 형태 유지와 효율적인 RDX 분해 과정을 수행하기 위해서 필요하다는 것을 의미하였다.