• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권5호
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• pp.359-363
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• 1986

본 실험의 목적은 starch의 alcohol발효에 있어서 전분의 $\alpha$-1.4 linkage을 분해하여 alcohol발효를 하는 S diastaticus와 전분 중의 $\alpha$-1.4, $\alpha$-1.6 linkage를 모두 분해할 수 있는 C. tropicalis 간의 이속간의 protoplast fusion을 시켰다. 이때 세포 융합의 빈도는 $10^{-5}$-$10^{-6}$이였으며, 이틀 융합체중 amylase 생성능과 유전적으로 안정한 융합체를 분리하였다. fusant의 성질을 조사하기 위하여 탄소원 자화능을 조사한바 parent와 달리 탄소원 자화능이 일부 보완됨을 보였고 또한 fusant는 원 parent보다 세포의 크기가 클 뿐만아니라, DNA함량도 많았다. spore형성능은 S. diastaticus A4는 spore를 형성하나 C. tropicalis는 형성할 수 없는 반면에 fusant는 형성하였고, Cu$^{++}$ 내성과 NaCl 내염성도 조사하였는데 fusant는 parent의 중간 성질을 가졌다. Fusant의 증식율을 조사하기 위하여 생육도를 조사한 결과 Parent보다 유도기가 길었음을 알았다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제35권6호
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• pp.575-584
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• 2019

Colletotrichum acutatum is a species complex responsible for anthracnose disease in a wide range of host plants. Strain C. acutatum KC05, which was previously isolated from an infected pepper in Gangwon Province of South Korea, was reidentified as C. scovillei using combined sequence analyses of multiple genes. As a prerequisite for understanding the pathogenic development of the pepper anthracnose pathogen, we optimized the transformation system of C. scovillei KC05. Protoplast generation from young hyphae of KC05 was optimal in an enzymatic digestion using a combined treatment of 2% lysing enzyme and 0.8% driselase in 1 M NH₄Cl for 3 h incubation. Prolonged incubation for more than 3 h decreased protoplast yields. Protoplast growth of KC05 was completely inhibited for 4 days on regeneration media containing 200 ㎍/ml hygromycin B, indicating the viability of this antibiotic as a selection marker. To evaluate transformation efficiency, we tested polyethylene glycol-mediated protoplast transformation of KC05 using 19 different loci found throughout 10 (of 27) scaffolds, covering approximately 84.1% of the entire genome. PCR screening showed that the average transformation efficiency was about 17.1% per 100 colonies. Southern blot analyses revealed that at least one transformant per locus had single copy integration of PCR-screened positive transformants. Our results provide valuable information for a functional genomics approach to the pepper anthracnose pathogen C. scovillei.

• 식물조직배양학회지
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• 제22권6호
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• pp.339-343
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• 1995

철이온이 Arabidopsis thaliana의 mesophyll protoplasts 배양에 미치는 영향을 조사하기 위하여 mesophyll protoplasts를 분리한 후 변형시킨 IMH 배지에 서로 다른 농도의 Fe-EDTA를 조성하여 배양하는 동안 나타나는 현상들을 관찰하였다. 세포분열률, 미세캘러스의 생장 및 첫번째 세포분열의 시기 등이 Fe-EDTA 농도에 따라 현저히 달라짐을 확인하였다. 대조군에서는 전혀 세포분열이 관찰되지 않았으며, 0.02 mM 미만의 저농도에서는 세포분열률이 낮았다. 0.5-1 mM에서 가장 빠른 세포분열과 높은 분열률을 보였으며 미세캘러스의 형성과 생장도 가장 빨랐다. 낮은 농도(0-0.25 mM)의 Fe-EDTA가 첨가된 배지에서는 농도의 증가와 비례하여 분열률이 높아졌고, 첫 세포분열의 시기와 미세캘러스의 생장 또한 농도의 증가에 비례하여 촉진되는 것으로 나타났다. 그러나 이러한 현상은 1 mM에서최고치를 보인 후 그 이상의 농도에서는 농도의 배가에 따라 효율이 현저히 감소되는 것으로 관찰되었다. 본 연구에서 엽육세포 원형질체의 세포분열 및 미세캘러스의 생장이 최대로 나타났던 0.5-1 mM 철이온 농도는 현재 일반적으로 사용되고 있는 배지들에 비해 5-10배의 높은 농도이다.

• 한국균학회지
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• 제14권4호
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• pp.273-280
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• 1986

Rhizorus oryzae의 생장 및 autolysis에 따른 여러가지 autolytic enzymes의 활성도 변화와 이 autolytic enzyme system을 이용한 원형질체 생성에 관하여 조사하였다. Autolytic·phase의 culture filtrate 내에 함유된 autolytic enzyme은 Rh. oryzae 균사체로부터의 원형질체 생성에 효율적인 세포벽 분해효소로 작용하였으며 Autolytic enzyme중 원형질체 생성은 proteolytic 및 chitosanase activity와 가장 긴밀하게 관련되어 있었다. 이와같은 autolytic enzyme을 이용한 원형질체 생성은 10시간 배양한 균사체에 0.5M mannitol을 사용하였을 때 최고의 수율을 보였으며 원형질 생성의 최적온도 및 pH는 각각 $25{\sim}30^{\circ}C$ 및 $6.0{\sim}6.5$로 나타났다 한편 18시간 배양된 균사체를 osmotic stabilizer와 aut-olytic enzyme을 1 : 1이 되도록 처리하고 5시간 동안 $30^{\circ}C$에서 incubation하여 얻은 원형질체를 주사전자현미경으로 조사한 결과 효소에 의하여 가수분해되는 세포벽 주변으로부터 원형질체가 형성되는 것을 확인하였다.

• 한국작물학회지
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• 제42권3호
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• pp.306-316
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• 1997

약배양을 통해 유도된 벼의 품종 Zhonghua 8의 종자로부터 배발생 캘러스를 유기한 캘러스로부터 현탁배양을 실시하였다. 원형질체 분리 는 이러한 현탁배양된 캘러스를 사용하였으며, 일반적으로, 오래되고 미세한 현탁배양세포를 사용했을 때 어린 현탁배양세포보다 원형질체 나출율이 증가되었다. 원형질체는 feeder cell 없이 agarose embedding 방법에 의해 0.5 mg $l^{01}$ 2,4-D, 1.0mg $l^{-1}$ NAA와 0.5 mg $l^{-1}$zeatin이 첨가된 KPR 배지에서 배양하였을 때 세포분열이 일어났으며 microcalli가 형성되었다. 원형질체의 plating 효율은 0.20~0.54% 범위로 나타났으며, 원형질체로부터 유도된 microcalli는 식물체 재분화를 위해 2.0 mg $l^{-1}$ kinetin과 0.5 mg $l^{-1}$ NAA가 첨가된 MS 배지에 옮겨 주었다 실물체 재분화 빈도는 현탁배양의 line에 따라 2~l2%였다. 원형질체로부터 재분화된 식물체들은 온실에서 종자를 맺었다었다

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권3호
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• pp.213-218
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• 1989

Cloning을 위한 host와 vector의 이용 가능성을 타진하기 위해 호알칼리성 Bacillus속 K-17을 host로, pUB110과 pBD64를 vector로 사용하여 Bacillus속 K-17의 protoplast 형질전환조건을 검토하였다. 원형질체의 형성은 200$\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 Iysozyme 을 처리하였으며, 원형질체 형성의 최적 온도, PH및 배양시간은 각각 4$0^{\circ}C$, 7.0 및 4시간으로 나타났다. 원형질체는 DM3 재생배지에서 재생시켰으며 0.8% agar, 0.5M sodium succinate 농도에서 가장재생이 좋았다. 형질전환시 PEG의 농도는 40%(w/v) PEG 6,000 30%(v/v)가 최적으로 나타났다. 형질전환체의 특성을 조사한 결과, plasmid 안정성은 pUB110이 pBD64보다 더 안정하였으며, 최대 효소활성은 비슷하였지만 효소 분비시간은 pUB110 은 2.5일, pBD64의 경우는 3일로 Bacillus속 K-17의 2일에 비해 약간 지연되었다.

• 미생물학회지
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• 제28권4호
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• pp.304-310
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• 1990

고온 혐기성 Clostridium thermocellum 및 Clostridium thermohydrosulfuricum의 원형질체 형성 및 재생조건에 대하여 조사하였다. 원형질체 형성은 C. thermocellum의 경우, 0.2% glycine을 첨가한 배지에서 초기대수증식까지 생육한 cell을 0.5mg/ml의 lysozyme을 함유한 100mM TMG buffer(pH 7.5)에서 $37^{\circ}C$, 2시간 처리 했을 때 가장 좋았으며, C. thermohydrosulfuricum은 대수증식기의 cell을 동일 조건에서 0.2mg/ml의 lysozyme으로 처리했을 때 양호하였다. 원형질체 재생은 0.3-0.4M sorbitol. 0.5% casamino acid, 고농도의 $CaCl_2$를 첨가한 재생배지에서 $60^{\circ}C$, 7-10일간 배양했을 때 잘 되었으며, 원형질체 형성시 lysozyme의 처리 시간이 짧을 수록 좋았다. 재생빈도는 C. thermocellum의 경우 $4.85{\times}10^{-3}$, C. thermohydrosulfuricum의 경우 $4.23{\times}10^{-2}$ 이하로 낮은 편이었다. 재생배지에 나타난 colony에는 완전히 재생되지 않은 L-form cell도 함께 존재하였다.

• 한국식품과학회지
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• 제20권2호
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• pp.164-169
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• 1988

간장덧에 분리 동정한 Zygosaccharomyces rouxii M-12 와 Saccharomyces cerevisiae M-43간의 원형질체 융합에 의한 새로운 간장효모균주를 개량할 목적로 영양요구성 돌연변이주인 Zygosaccharomyces rouxii ZRM-83 ($Met^-,\;Thr^-$)과 Saccharomyces cerevisiae SCM-465($Lys^-,\;Arg^-$)을 얻었다. 양 균주의 원형질체 형성의 조건은 Zymolase 20T을 0.5mg/ml, 60분에서 많이 생성하였고 원형질체 융합조건은 30% PEG6,000을 30분간 처리했을때 융합빈도는 $10^{-4}{\sim}10^{-5}$이였다. 융합체의 세포크기는 진주보다 컸으며 DNA함량도 많았다.

• 한국작물학회지
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• 제27권2호
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• pp.147-154
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• 1982

식물원형질체를 이용하여 체세포잡종을 육성하기 기초자료를 얻고자 식물의 엽육부위, Callus에서 효과적인 원형질체의 분리, 적합한 배양조건 및 세포융합에 관한 조건을 조사한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 배양 융합조건에 적합한 식물원형질체의 분리 방법은 여러 종류의 효소농도에 따라 다르지만 담배 및 완두엽육 원형질체분리에는 Macerozyme 0.5%, Cellulase 2.0%, KDS 0.5%, Mannitol 0.7M의 효소용액에 처리시 활성 있는 원형질체를 얻을 수 있었다. 2. 배양중인 담배 및 대두의 Callus로부터 원형질체분리는 배양기간에 따라 세포활성도가 떨어지거나 쉽게 파괴되는 현상을 보여 양호한 원형질체를 얻을 수가 없었다. 3. 원형질체의 배양은 배양배지에 Plating할 경우 세포농도에 따라 차이가 있었으며 1.0$\times$$10^4$/ml이상이어야 분열이 가능하였고 배양조건은 150Lux 12시간 광암처리후가 세포분열 및 증식이 가장 왕성하였다. 4. 세포융합은 PEG농도가 중요하며 PEG 1500 0.33M에서 CaCl_2농도가 높을수록 융합율이 증가되는 경향이었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제33권1호
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• pp.93-100
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• 1990

Petunia, 당근 및 대두의 Protoplast를 전기자극법으로 융합시킬 때의 적정 전기자극 조건과, petunia protoplast의 융합율 그리고 또는 viability에 대한 calcium, magnesium, pretense, trypsin, triton X-100, concanavalin A, dimethyl sulfoxide(DMSO), glycerol monooleate 그리고 spermine의 영향을 조사하였다. Protoplast pearl chain 형성을 위한 교류의 주파수와 전압은, Petunia의 경우 10kHz-20 V/cm와 1 MHz-60 V/cm, 당근의 경우에 100 kHz-40 V/cm와 $1\;MHz-40{\sim}80\;V/cm$, 그리고 대두의 경우에 $1\;MHz-40{\sim}80\;V/cm$가 양호하였다. Protoplast융합을 위한 최적 직류 처리조건은, petunia의 경우에 교류를 1MHz, 60 V/cm (15 sec) 처리한 후 직류를 2.5 kV/cm, $40\;{\mu}sec$ 처리했을 때였는데, 이 때 Protoplast의 생존율 과 융합율은 각각 45 %와 10 %였다. 당근과 대두의 경우는 처리시간에 관계없이 직류 2.5 V/cm 이하에서는 융합이 일어나지 않았고, 2.5 V/cm 이상에서는 protoplast가 파괴되었다. Calcium은 전기자극융합을 촉진시켰는데, 최적 농도는 140 mM이었고 이 때 protoplast의 생존율과 융합율은 43 %와 11 %였다. Magnesium은 융합촉진효과가 없었으나 calcium이 존재할 때는 융합을 촉진하였는데, calcium 140 mM일 때 최적 magnesium농도는 140mM이었고, 이때의 생존을과 융합율은 각각 45%와 13%였다. 융합배지에 protease, trypsin, triton X-100, concanavalin A, DMSO, glycerol monooleate, spermine을 처리했을 때 융합율은 대조구(11.2 %)에 비해 각각 2.4, 2.1, 1.6, 1.4, 1.8, 1.5, 2.2배로 증가하였고, 생존율은 각각 37 %, 35 %, 38 %, 41 %, 31 %, 37 %, 42 %로 대조구(45.2 %)에 비해 모두 저하되었다.