Kim, Byung-Oh;Shin, Sung-Seup;Yoo, Young-Hyo;Pyo, Shuk-Neung
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
제10권1호
/
pp.56-62
/
2000
The hpa gene genetically linked to the ctxa2b gene was cloned into the pTED expression vector, and the constructed pTEDhpa/ctxa2b was transformed into Excherichia coli. The fusion protein, the adhesin fused to the cholera toxin subunit A2B (CTXA2B) subunit, was expressed to high levels as inclusion bodies in E. coli. The expressed protein was partially purified by washing the inclusion bodies with working solution containing 8M Urea and 0.1M DTT. Refolding of denatured fusion protein was carried out in the presence of glutathione redox buffer. The refolded fusion protein was purified by size exclusion chromatography. The expressed fusion protein was verified by SDS-PAGE, western blotting with antibodies to both antigenic components of adhesin and cholera toxin subunit B (CTXB), and its N-terminal amino acid sequence was analyzed. The orderly assembled fusion protein was confirmed by modified Gm1-ganglioside ELISA with Abs to adhesin. The results indicate that the purified fusion protein is an Adhesin/CTXA2B protein containing the H. pylori adhesin and $G_{m1}4-ganglioside binding activity of CTXB and the expressed fusion protein in E. coli could be easily purified by the refolding process, Its molecular weight was 168kDa as estimated by size exclusion chromatography. The Adhesin/CTXA2B protein may be used as a candidate antigen for oral immunization against H. pylori.
Ristl, Robin;Kainz, Birgit;Stadlmayr, Gerhard;Schuster, Heinrich;Pum, Dietmar;Messner, Paul;Obinger, Christian;Schaffer, Christina
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
제22권9호
/
pp.1271-1278
/
2012
Genetic fusion of two proteins frequently induces beneficial effects to the proteins, such as increased solubility, besides the combination of two protein functions. Here, we study the effects of the bacterial surface layer protein SgsE from Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a on the folding of a C-terminally fused enhanced green fluorescent protein (EGFP) moiety. Although GFPs are generally unable to adopt a functional confirmation in the bacterial periplasm of Escherichia coli cells, we observed periplasmic fluorescence from a chimera of a 150-amino-acid N-terminal truncation of SgsE and EGFP. Based on this finding, unfolding and refolding kinetics of different S-layer-EGFP chimeras, a maltose binding protein-EGFP chimera, and sole EGFP were monitored using green fluorescence as indicator for the folded protein state. Calculated apparent rate constants for unfolding and refolding indicated different folding pathways for EGFP depending on the fusion partner used, and a clearly stabilizing effect was observed for the SgsE_C fusion moiety. Thermal stability, as determined by differential scanning calorimetry, and unfolding equilibria were found to be independent of the fused partner. We conclude that the stabilizing effect SgsE_C exerts on EGFP is due to a reduction of degrees of freedom for folding of EGFP in the fused state.
The recombinant human interferon alpha 2a ($rhIFN-{\alpha}2a$), expressed in Saccharomyces cerevtsiae, was purified from insoluble aggregates. The inclusion body of $rhIFN-{\alpha}$ was solubilized by guanidine salt in the presence of disulfide reducing agent. The refolding of denatured $rhIFN-{\alpha}2a$ was achieved by simple dilution. The authentic interferon alpha, which has two correctly matched disulfide bonds, was seperated from incompletely oxidized $IFN-{\alpha}$ and dimeric $IFN-{\alpha}$ by use of a CM-Sepharose column, followed by size exclusion columns at two different pH conditions. The purified protein has been subjected to detailed physicochemical characterization including sequence determination. Unlike other $rhIFN-{\alpha}2a$ from E. coli reported, the $rhIFN-{\alpha}2a$ from S. cerevisiae has no methionine residue at its N-terminus originating from the start codon, ATG. The pI of the protein was determined to be 6.05 with a single band in the pI gel, which demonstrated that the purified $rhIFN-{\alpha}$ was homogeneous. The structural study using circular dichroism showed that the protein retains its three dimensional structure in the wide range of pH conditions between pH 3 and 9, and only minor strucural deformation was observed at pH 1.0.
A mature mutant ribose binding protein (RBP) of Escherichia coli was obtained by site-directed mutagenesis, replacing Thr-3 in the N-domain of wild-type mature RBP (WT -mRBP) with a Trp residue (N- Trp-mRBP). The equilibrium unfolding properties and the refolding kinetics of this protein were monitored by fluorescence and circular dichroism (CD). (omitted)
최근 북극해의 축치해(Chuckchi Sea)로부터 저온지질분해 효소활성을 보이는 Psychrobacter sp. ArcL13 균주가 분리되었다. 그러나 낮은 발현 양 때문에, 이 효소의 다양한 분야에서의 활용에 제약을 받아왔다. 따라서 유전자 재조합 기술을 이용하여, 이 효소를 대량생산하는 기술개발이 필요하였다. 재조합 지질분해효소를 만들기 위해서는 우선 해당 유전자의 동정이 필요하였기 때문에, Psychrobacter sp. ArcL13 균주로부터 PCR을 이용한 gene prospecting 방법으로 새로운 지질분해효소 유전자인 ArcL13-Lip을 분리하고 전체 염기 서열을 규명하였다. 염기 서열 분석결과 ArcL13-Lip은 일부 Psychrobacter 속 박테리아 유래의 지질분해효소들과 염기 서열의 유사성은 낮지만, 84-90%의 아미노산 서열 유사성을 보였다. ArcL13-Lip 전체 유전자를 대장균에서 발현시키고 전기영동으로 분석한 결과, 재조합 ArcL13-Lip은 약 35 kDa의 분자량을 보였으며 단백질 봉입체 형태로 발현되었다. Unfolding된 ArcL13-Lip을 다양한 첨가물이 포함된 완충용액에서 refolding 시킨 결과, glucose에 의해서 refolding 효율이 가장 크게 증가하였다. Refolding된 재조합 ArcL13-Lip은 다양한 p-nitrophenyl ester 중 p-nitrophenyl caprylate과 p-nitrophenyl decanoate에 대해 가장 높은 효소활성을 보였다. 온도에 따른 효소활성을 조사한 결과 ArcL13-Lip은 $40^{\circ}C$에서 최고의 활성을 나타내었고, $10^{\circ}C$와 $20^{\circ}C$에서 각각 최고 활성 대비 약 40%와 73%의 효소활성을 나타내었다. 이와 같이 ArcL13-Lip은 전형적인 저온활성 효소의 특징을 보여주었다.
재조합 인성장호르몬을 사용하여 in vitro 재접힘 공정(풀림, 희석에 의한 공기 중 산화, 그리고 투석)을 수행하였다. 표면소수성이 풀림-재접힘 공정에 중요한 역할을 한다는 것을 형광값의 변화를 통하여 알 수 있었다. 변성제의 intermediate 농도는 Urea와 Gu-HCl 경우 하나의 peak로 SDS와 Sarkosyl의 경우 두개의 peak로 나타났다. 형광값의 변화 중 특이한 점은 Urea의 경우 공기 중 산화와 투석 중의 후반부에 형광값이 증가한다는 것이다. 따라서 공기 중 산화도중 형광값이 증가하기 전에 투석을 시킨 결과 형광값이 증가를 막을 수 있었다. 아직 이 원인에 대해 자세히 알 수 없지만 계속 실험 중에 있다. 이번 실험에서 표면소수성 변화와 연관시켜 fluorescence를 이황화결합에 의한 산화된 형태를 알아보기 위한 방법으로 RP-HPLC를 마지막으로 단백질의 2차원적인 구조를 알아 보기 위해 CD를 사용하였다. CD측정 결과 Gu-HCl보다 SDS의 경우 ${\alpha}$-helices의 파괴가 더 많음을 볼 수 있었다. 재접힘된 rhGH는 본래의 2차원적 구조의 90%이상을 얻을 수 있었다. 이 실험이 기지는 의의는 이 모든 실험결과를 토대로 단백질 재접힘을 모니터링 하였다는 점이다. 즉, 형광값의 변화를 통하여 형광값이 증가하는 것은 표면 소수성이 증가함을 보이는 것으로 단백질의 풀림이 일어난 것이고 3차원적 구조가 깨지고 2차원 구조를 알아 볼 수 있는 ${\alpha}$-helices의 감소를 의미하였다. 이와는 반대로 형광값이 감소하는 것을 통해 재접힘이 일어남을 알 수 있었고, 이러한 결과를 바탕으로 단백질의 재접힘 공정의 변화과정을 형광값을 통하여 모니터링 할 수 있었다. 또한 이 실험의 목적 단백질은 rhGH이지만 다른 단백질에 적용이 될 경우 단백질 재접힘 과정을 수시로 모니터링하고 상태를 예측할 수 있으므로 산업현장에서 소량의 sample로 재접힘 상태를 쉽고 빠르게 판단할 수 있을 것이다. 단백질 재접힘 과정에서 이러한 개념의 성공적 도입은 단백질 회수 수율을 높임으로써 생물분리공정 분야의 기술 발전에 이바지 하리라 사료된다.
비휘발성, 비폭발성, 열적 안정성의 특성을 가지고 있는 이온성액체는 환경친화적인 용매이고, 또한 양이온과 음이온의 다양한 조합을 통해 사용 목적에 부합하는 이온성액체를 용이하게 합성할 수 있어 용매로서의 다양성으로 인해 청정 용매, 촉매, 추출 및 분리, 전해질 등의 분야에서 다양하게 응용되고 있다. 이에 본 논문에서는 이온성액체에 대한 기본 지식와 함께 현재 미생물생명화학공정에서 이온성액체가 용매로서 효과적으로 응용되고 있는 효소반응 분야, 단백질 재접힘 분야, 바이오매스 용해 및 활용분야에서의 최근 연구동향을 기술하였다.
Kim, Hyoung-Won;An, Eun-Kyoung;Shin, Mi-Young;Kim, In-Ho
한국생물공학회:학술대회논문집
/
한국생물공학회 2003년도 생물공학의 동향(XIII)
/
pp.544-547
/
2003
Fusion $ferritin(F_H+F_L),$ an iron-binding protein, was purified from recombinant E. coli by gel filtration chromatography after two-step sonications. Unfolded ferritin was refolded by GFC with various refolding enhancing additives. 50 mM Tris-HCI(pH 7.4) buffers containing 2 M urea and additive was used in GFC. Objective was to characterize the structure change at various conditions. Molecular weight was determined using GF-HPLC and RP-HPLC was used to quantify the unfolded and refolded proteins. Activity was confirmed by iron-uptake reaction.
혈관 내피세포 성장인자(Vascular endotherial growth factor, VEGF)는 혈관 투과율 조절이나 혈관 생성에 관련된 단백질로 임상용으로 쓰일 가능성이 높다. 이 단백질은 고순도와 고효율로 상업적으로 대량생산이 필요하다. 유비퀴틴 융합 단백질로 온화한 조건에서 용해시키기 위해 다양한 조건을 연구하였고, pH와 변성제 변화를 시도하였다. BL21 (DE3) 대장균 숙주세포에서 pET28-a 벡터를 사용하여 재조합 대장균을 제조하여, 20 L의 회분식 배양으로 14 g/L농도의 세포배양을 하였다. 발효 후UBP1 효소 분해와 재접힘 단계를 포함한 4단계의 크로마토그래피 공정으로 구성된 정제공정으로 VEGF를 정제하였다. 유비퀴틴 융합단백질로 2 M 요소와 pH10 온화한 조건에서 VEGF의 정제가 가능하였다. 2번의 Ni-affinity 크로마토그래피컬럼을 이용하여 고효율의 재접힘과 이합체화 공정을 수행하였다. DEAE (Diethyl Amino Ethyl) 음이온 교환 컬럼을 통하여 변형체(multimeric, misfolded)단백질과 endotoxin을 제거 할 수 있었다. 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 dimer와 monomer를 분리 하여 이합체화 VEGF를 제조하였다. 최종 VEGF의 특성분석을 SDS-PAGE (Soidum Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 전기영동, RP-HPLC (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography)으로 하여 순도 97% (RP-HPLC기준)를 얻었다.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.